常用分子生物学试剂的选择中文

常用分子生物学试剂的选择中文第一页，共四十一页，2022年，8月28日用于分子克隆的工具酶

限制性核酸内切酶DNA聚合酶DNA连接酶

核酸酶

核酸修饰酶第二页，共四十一页，2022年，8月28日如何选择最合适的限制性内切酶限制性核酸内切酶的生物功能影响限制性核酸内切酶活性的因素第三页，共四十一页，2022年，8月28日限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的生物功能

主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链细菌的限制与修饰作用hsdR：编码限制性核酸内切酶hsdM：编码限制性甲基化酶hsdS：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达第四页，共四十一页，2022年，8月28日主要特性I型II型III型限制修饰蛋白结构辅助因子识别序列切割位点异源三聚体多功能同源二聚体异源二聚体距识别序列1kb处随机性切割旋转对称序列TGAN8TGCTAACN6GTGC距识别序列下游24-26bp处识别序列内或附近特异性切割GAGCC限制性核酸内切酶的类型限制性核酸内切酶单功能双功能ATPMg2+SAMMg2+ATPMg2+SAM第五页，共四十一页，2022年，8月28日限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶属名种名株名Haemophilunitssinflunitsenzae

d

嗜血流感杆菌d株HindIII同一菌株中含多个不同的限制性核酸内切酶,表示在该菌株中发现这种酶的先后次序。第六页，共四十一页，2022年，8月28日限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构EcoRI的切割位点EcoRI的识别序列5’…GCT

GAATTC

GAG…3’3’…CGA

CTTAAG

CTC…5’第七页，共四十一页，2022年，8月28日EcoRI等产生的5’粘性末端

5’…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’

3’…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃

3’…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’

5’…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’5’…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’OHPOHP退火4-7℃第八页，共四十一页，2022年，8月28日PstI等产生的3’粘性末端5’…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3’

…

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C

…

5’5’…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’5’…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃退火4-7℃OHPOHP第九页，共四十一页，2022年，8月28日PvunitsII等产生的平头末端5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvunitsII37℃5’…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3’…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’第十页，共四十一页，2022年，8月28日影响限制性核酸内切酶活性的因素DNA样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10units酶加大反应总体积延长反应时间措施：第十一页，共四十一页，2022年，8月28日DNA样品的甲基化程度：大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、MboI等，但BamHI、

BglII、Saunits3AI不受影响

大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等哺乳动物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基影响限制性核酸内切酶活性的因素第十二页，共四十一页，2022年，8月28日核酸内切酶的缓冲液性质：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Staractivity现象EcoRI在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5‘PunitsPunitsATPyPy3’或者5‘AATT3’影响限制性核酸内切酶活性的因素第十三页，共四十一页，2022年，8月28日星号活性

在非标准反应条件下,也能切割一些与其特异识别序列类似的序列。在酶的名称右上角加一个星号(*)表示,如EcoRⅠ*。必须采用规范的实验步骤,坚持应用推荐的反应条件。第十四页，共四十一页，2022年，8月28日同裂酶(isoschizomer)或异源同工酶:不同来源的限制酶可切割同一靶序列同尾酶(isocaunitsdiners)：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。远距离裂解酶(distantcleavage)：识别位点与切割位置不一致可变酶：识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的Sunitsbset酶：一种酶的识别序列包含于另一些酶的识别序列之中第十五页，共四十一页，2022年，8月28日

酶切反应注意事项价格昂贵的酶决不能用水稀释,以免变性失活。预先加入除酶以外的所有其他试剂。取酶立即放于冰上。分装小份避免反复冻融。使用无菌的新吸头。少加水,使体积最小,但保证酶液体积不超过总体积的10％,否则酶液中的甘油会抑制酶活性。

第十六页，共四十一页，2022年，8月28日常用内切酶的单位价格比较

产品名称公司规格价格单位价格BamHIN50002800.056T20001200.06P25002600.104BglIIN10002800.28T5001200.24P5002280.456DpnIN5003100.62T

P2003841.9175HindIIIN50002800.056T30001200.04P50001560.03NdeIN20003100.115T4002000.5P5007411.482第十七页，共四十一页，2022年，8月28日如何选择最合适的DNA聚合酶DNA聚合酶的特性PCR

实验的不同需求第十八页，共四十一页，2022年，8月28日DNA聚合酶的特性纯度稳定性酶活性第十九页，共四十一页，2022年，8月28日PCR

实验的不同需求长片段扩增PCR试剂盒

扩增效率

保真性

特异性

基因组扩增、RT-PCR

基因筛选、测序、基因克隆

复杂模板扩增（GC含量高、二级结构）构建基因图谱、测序、分子遗传学

复杂模板扩增、大规模基因检测第二十页，共四十一页，2022年，8月28日特异性－热启动Taq酶原理

蜡封抗体抑制化学修饰特点

避免非特异性扩增提高PCR反应的特异性用途

基因组扩增

RT-PCR第二十一页，共四十一页，2022年，8月28日TaqDNA聚合酶

厂商及货号规格价格￥应用范围与产品特性

热启动TaqDNA聚合酶Invitrogen10966-018100rxn1,0505u/ul，用于提高聚合酶链反应特异性的自动“热启动”Invitrogen10966-026250rxn2,510Invitrogen10966-034500rxn4,540MBIER0601100u600

TakaraDR007A250u350适用于HotStartPCR法扩增DNA和DNA序列测定。TakaraDRR006A250u550SGB0095-100U

100u300HeatstartTaqSG

B0095-200U

200u540SGB0095-500U

500u1,100TiangenET102-01250u200超纯特异性最强的耐热DNA聚合酶TiangenET102-02500u380第二十二页，共四十一页，2022年，8月28日保真性—高保真酶原理用途

表达基因的克隆基因的定点突变细胞内基因点突变分析（SNP）

3’-5’核酸外切酶活性降低碱基错配率

第二十三页，共四十一页，2022年，8月28日TaqDNA聚合酶

厂商及货号规格价格￥应用范围与产品特性

高保真DNA聚合酶Invitrogen12344-024200rxn3,180AccPrimePfxDNA聚合酶，具有高产量和高特异性的特高PCR保真度，为普通Taq的26倍，可扩增12kbDNA。PCR优化最小化。Invitrogen12344-0321000rxn15,070

Invitrogen12344-040200rxn3,980AccPrimePfxSuperMix，同上。Invitrogen12346-086200rxn3,210AccuPrimeTaq，具有高特异性和高产量的高保真度PCR，为普通Taq的9倍，可扩增20kbDNA。PCR优化最小化。Invitrogen12346-0941000rxn14,270Invitrogen11304-011100rxn1,610PlatinumTaq，5u/ul，RobustPCR扩增具有高产量,保真度为普通Taq的6倍，可扩增20kbDNA。室温反应组装。Invitrogen11304-029500rxn7,140Invitrogen11304-1025000rxn60,010Invitrogen12532-016100rxn2,270PlatinumPCRSuperMix，1.1X，同上。MBIK0191100u398HighFidelityPCREnzymeMix,可扩增10-20kbDNA。TakaraDRR100A250u280ExTaq,比普通Taq扩增效率高，保真度为其4倍。TakaraDR006A200u600Z-Taq,反应速度约为普通Taq的5倍，保真度为3倍。TakaraDR005A125u400PyrobestDNAPolymerase,保真度为普通Taq的10倍。第二十四页，共四十一页，2022年，8月28日高保真＋

高扩增效率原理

混合酶－高扩增效率－3’－5’核酸外切用途

超长片段扩增

－测序

－构建基因图谱

复杂模板扩增－GC含量高－二级结构第二十五页，共四十一页，2022年，8月28日PfunitsDNA聚合酶MBIEP0571100units545native,blunitsnt-endPCRprodunitsct,Errorrate:2.6x10-6MBIEP0501100units198recombinant,Errorrate:2.6x10-6PromegaM7741100units2–3units/μlSBSEP-500500units200耐热，尤其适用于高保真扩增长度为3kb以下的片段SGB0093-100units

100units60SGB0093-200units

200units100

SGB0093-500units

500units200SGB0094S-100units

100units120SunitsperPfunitsSGB0094S-200units

200units220SGB0094S-500units

500units450

Stratagene600135100units1250native;高保真vsTaq:6X;<10KbStratagene600153100units1200cloned;高保真vsTaq:6X;<10KbTiangenEP101-01250units150超纯高保真耐热DNA聚合酶，配有10×PfunitsBunitsfferTiangenEP101-02500units280Pfunits热启动

DNA聚合酶Stratagene600390100units1,500热启动;高保真vsTaq:20X;<19KbPhunitssionDNAPolymeraseNEBF-530S100units1,250高保真vsTaq:50X;Template:20Kb

PhunitssionHotstartDNAPolymeraseNEBF-540S100units1,500热启动;高保真vsTaq:50X;20KbVentDNAPolymeraseNEBM0254V100units310高保真vsTaq:5XNEBM0254S200units696DeepVentDNAPolymeraseNEBM0258V100units445高保真vsTaq:>6X产品名称

厂商及货号

规格价格￥应用范围与产品特性

第二十六页，共四十一页，2022年，8月28日PhunitssionDNAPolymeraseNEBF-530S100units1,250长片段高保真;高保真vsTaq:50X;Template:20Kb

PhunitssionHotstartDNAPolymeraseNEBF-540S100units1,500热启动;高保真vsTaq:50X;20Kb

LongPCREnzymeMixMBIK0181100units3985units/unitsl,可扩增21-47kbLongPCRControlSetMBIK020125rxn398test20-30kbPCRfragmentsExpandLongTemplatePCRSystemRoche11681834001150units1,400HunitsmangenomicDNA:5-27Kb

AccunitsTaqLADNAPolymeraseSigmaD8045-125unitsN125units1,300高保真vsTaq:6.5X;genomicDNA:<20Kb

JunitsmpStartAccunitsTaqLADNAPolymeraseSigmaD5809-125unitsN125units1,550HotstartPCREXLDNAPolymeraseStragagene600340100units1,200高保真

vsTaq:3X;GenomicDNA:<37Kb;vectorDNAtemplate:<50KbPfunitsunitsltraIIFunitssionHSDNAPolymeraseStratagene60067040rxn1,250GenomicDNA:<19Kb;cDNA:<9.6KbPfunitsunitsltraHotstartDNAPolymeraseStratagene600390100units1,500热启动;高保真vsTaq:20X;<19KbEXTaqTaKaRaDRR001A250units350GenomicDNATemplate:<20KbLATaqTaKaRaDRR002A125units300GenomicDNATemplate:<20Kb，

保真度为普通Taq的7倍。V-TaqSBSEVT-500500units260V-Taq,尤适合复杂长片段扩增,能扩增10kb

的动植物基因组DNA和20kb的LambdaDNA。超纯长片段扩增耐热DNA聚合酶TiangenET103-01250units150配有10×LongTaqBunitsffer超纯长片段扩增耐热DNA聚合酶TiangenET103-02500units280TaqDNAPolymerase10xReactionBunitsfferPromegaM1881750unitsl50withMgcl2

产品名称

厂商及货号

规格价格￥应用范围与产品特性

第二十七页，共四十一页，2022年，8月28日PCR

MasterMix原理预配好的PCR反应液

DNA聚合酶反应缓冲液

dNTPPCR增强剂

PCRMasterMix第二十八页，共四十一页，2022年，8月28日PCR

MasterMix特点

快速简便减少加样误差和污染

灵敏度高

可扩增低至2个拷贝的目的模板

特异性强降低PCR反应的要求，增强特异性

稳定性好长期放置活性无改变适用范围

大规模基因检测目的基因拷贝数极低的样本

GC含量高,有二级结构的模板复杂基因组样本可直接检测菌落，基因点突变检测,

或者阳性克隆的筛选。第二十九页，共四十一页，2022年，8月28日产品名称厂商及货号规格价格￥应用范围与产品特性

PCRMasterMix

PlatiunitsmqPCRSunitsperMix-unitsDGInvitrogen11743-100

2,250ForABI7000,7300,7700,7900(HT)2×PCRMasterMixMBIR01715ml87510050unitslrxns2×HostStartMasterMixMBIR02115ml1,0502XPCRMasterMixfor25020-unitslrxns;generates3'dAprodunitsctsunitspto4kbTaq2×MasterMixNEBM0270S8ml720400unitsTaq;Stableat4degreefor3monthsNEBM0270L5×8ml2,8802000unitsTaq;genomicDNA:4KbTaqPCRKitNEBE5000S200rxn1,200TaqDNApolymerase,dNTPs,DNAmarkerTaqPCRMasterMixQiagen2014433×1.7ml1,950250unitsTaqReadyMixTaqPCRReactionMixSigmaP4600-20RXN20rxn360WithMgCl2SigmaP4600-100RXN100rxn1,200

RedTaqReadyMixPCRReactionMixSigmaR2523-20RXN20rxn390Reddyeindicatesenzymeaddition&mixing;directloadingongel;highthrounitsgghpunitstapplicationsSigmaR2523-100RXN100rxn1,200Easy-AHighFidelityPCRmasterMixStratagene600640100rxn3,900

PfunitsunitsltraHotstartPCRMasterMixStratagene600630100rxn4,500VizarsSVGelandPCRClean-unitspSystemPromegaA928150preps562

第三十页，共四十一页，2022年，8月28日如何选择最合适的DNA修饰酶酶的作用第三十一页，共四十一页，2022年，8月28日DNA连接酶修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键连接多个平头双链DNA分子还可作用于RNA,但效率低得多,需ATP作辅因子。第三十二页，共四十一页，2022年，8月28日产品名称厂商及货号规格价格￥应用范围与产品特性

DNA连接酶T4DNA连接酶Invitrogen15224-017100unitsnits610

Invitrogen15224-025500单位2,090Invitrogen15224-041250单位1,210T4DNALigase"HICONC."Invitrogen15224-0904×500单位6,740MBIEL0015200units158

NEBM0202V10,000unitsnits335400,000unitsnits/mlNEBM0202S20000unitsnits756

NEBM0202L100,000unitsnits3,024NEBM0202M20000units756Highconcentrationat2,000,000unitsnits/mlNEBM0202T100,000units3,024PromegaM1794500units1,248

PromegaM1801100units312PromegaM1804500units1,209

TakaraD2011A25,000units120第三十三页，共四十一页，2022年，8月28日E.coliDNAligase作用于5’端带磷酸基团的DNA底物NAD+可促进该催化反应分子克隆使用不多，亦不能连接RNA。用途:cDNA第二链合成。第三十四页，共四十一页，2022年，8月28日产品名称厂商及货号规格价格￥应用范围与产品特性

DNA连接酶E.coliDNA连接酶Invitrogen18052-019100unitsnits420

NEBM0205V100unitsnits280NEBM0205S200unitsnits636

NEBM0205L1,000unitsnits2,544TakaraD2160A1,000unitsnits150

第三十五页，共四十一页，2022年，8月28日T4RNAligase催化单链DNA或RNA连接。主要用途是对RNA进行3＇末端标记第三十六页，共四十一页，2022年，8月28日产品名称厂商及货号规格价格￥应用范围与产品特性

RNA连接酶T4RNA连接酶MBIEL00211000units398NEBM0204S1000unitsnits636

NEBM0204L5000unitsnits2,544

PromegaM1051500units819TakaraD2050200units120

第三十七页，共四十一页，2022年，8月28日以核酸为底物的水解酶按底物专一性分：RNase、DNase、非专一性核酸酶按作用位点分：内切或外切酶

5‘-核酸酶或3’-核酸酶常用:BAL31核酸酶、S1核酸酶、绿豆核酸酶、RNaseARNaseT1、DNaseⅠ、外切核酸酶Ⅲ、λ噬菌体外切核酸酶等。许多核酸酶兼有内切和外切活性核酸酶第三十八页，共四十一页，2022年，8月28日产品名称厂商及货号规格价格￥应用范围与产品特性

核酸酶脱氧核