第9章胚胎培养与人工种子

第九章

植物胚胎培养与人工种子第一节植物胚胎培养第二节人工种子第一节植物胚胎培养植物胚胎培养包括幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养和试管受精等内容。植物胚胎结构一、胚胎培养概念1、胚胎培养指使胚或具胚器官在离体无菌条件下发育成幼苗的技术。广义胚胎培养研究还包括胚乳培养和试管受精等技术。胚电镜扫描图片2、胚培养指在无菌条件下将胚从胚珠或种子中分离出来，置于培养基上进行离体培养的方法。双子叶植物胚3、胚乳培养指处于细胞期的胚乳组织的离体培养。4、胚珠培养指未受精或受精后的胚珠离体培养。不同植物的胚珠形态结构倒生胚珠5、子房培养指授粉和未授粉的子房培养。它对于研究果实发育的生理、离体受精等有重要意义。6、试管受精指在无菌条件下培养离体的未受精子房或胚珠和花粉，使花粉萌发产生的花粉进入胚珠而完成受精过程。二、胚胎培养的应用1、克服远缘杂交的不育性，获稀有杂种植物2、打破种子休眠，提早结实，缩短育种年限3、使生活力低下或无生活力的种子萌发4、使柑橘类植物合子胚正常发育5、测定种子生活力6、获三倍体或单倍体植株7、快速繁殖特殊植物8、用于理论研究指在无菌条件下将胚从胚珠或种子中分离出来，置于培养基上进行离体培养的方法。三、胚的培养植物胚结构胚电镜扫描图片双子叶植物胚幼胚培养成熟胚培养

据培养目的不同剥取的离体胚发育时期的不同胚培养成熟胚培养一般较易获得成功（一）幼胚培养幼胚完全是异养的，离体条件下培养要求培养基成分复杂，培养不易成功。

幼胚培养时，其发育过程有以下几种发育方式：a、胚性发育，此种方式不能萌发成苗b、早熟萌发，长成的苗十分瘦弱c、产生愈伤组织，再由愈伤组织分化形成胚或不定芽（二）成熟胚培养成熟胚是自养的，培养基需要简单。主要目的:◆研究胚发育过程的形态建成◆生长调节物质的作用◆胚与胚乳相互关系和营养要求培养方法：A、将受精后成熟或未成熟种子或果实，用70%—75%酒精表面消毒消毒几分钟B、用0.1%升汞溶液或饱和漂白粉溶液消毒10min，无菌水反复冲洗C、无菌操作台上，直接或在解剖镜下剥取胚接种在培养基上

胚龄胚长度（μm）营养需要（培养基营养）早球形胚后球形胚心形胚鱼雷胚成熟胚20~6061~8081~450451~700700（最大极限）小于40μm长的胚所需营养尚不清楚大量元素、微量元素、VB1、VB6、烟酸、糖2%、IAA0.1mg/L+KT0.01mg/L大量元素、微量元素、VB1、VB6、烟酸、糖2%Ca（NO3）2480mg/L、KNO363mg/L、KCl42mg/L、MgSO463mg/L、KH2PO442mg/L、VB1、VB6、烟酸、糖2%Ca（NO3）2480mg/L、KNO363mg/L、KCl42mg/L、MgSO463mg/L、糖2%荠菜不同发育时期胚培养的营养需要胚乳是由两个单倍的极核和一个单倍的精子结合而成的3倍体组织。由它可获得无子结实的3倍体植株，进而可将它加倍成6倍体植株。

不同胚乳发育类型及发育时期直接影响外植体取材时期以及胚乳细胞产生愈伤组织频率。胚乳培养的后代，常发生细胞染色体数目变化，形成多倍体、非整倍体等。四、胚乳培养1、核型胚乳

◆被子植物中普遍的胚乳发育形式◆初生胚乳核的第一次分裂和以后的多次分裂，都不伴随壁的形成◆各个胚乳核呈游离状态分布在胚囊中◆发育到一定阶段后，常在胚囊外围的胚乳核之间出现细胞壁

◆为单子叶植物和具有离瓣花的双子叶植物中普遍存在，如小麦、水稻、玉米、棉花、油菜、苹果等（一）胚乳的发育类型2、细胞型胚乳

特点：◆初生胚乳核的分裂开始，即产生细胞壁，形成胚乳细胞◆无游离核时期大多数双子叶合瓣花植物是这样的胚乳，如番茄、烟草、芝麻等。3、沼生目型胚乳

◆核型胚乳与细胞型胚乳的中间类型◆初生胚乳核的第一次分裂将胚囊分隔为两室，其中珠孔端室比合点端室宽大◆核进行分裂形成状态的游离核，最后形成细胞（二）胚乳培养的关键A、胚乳发育时期的影响发育早期胚乳：操作不便，诱导率低游离核期或刚转入细胞期的核型胚乳：难得callus旺盛生长期胚乳：易诱导产生callus★旺盛期胚乳特征

§胚已分化完成

§胚乳已形成细胞组织

§充分生长，达到成熟大小

§外观为半透明的固体状

§富有弹性水稻：授粉后4d黑麦草：授粉后8~10d黄瓜：授粉后7~16d梨：授粉后20d大麦：授粉后10~20d玉米和小麦：授粉后8~12d一些草本植物胚乳培养的适宜取材时期一般情况下：接近成熟或完全成熟的胚乳callus诱导率很低，甚至无callus木本植物，如：桑寄生科、檀香科植物，其成熟胚乳和诱导产生callusB、培养基和激素的影响培养基：MS、B5、MT、White、LS等水解酪蛋白、酵母提取物也很必要

激素：要求特殊大麦胚乳只有在添加2，4-D的培养基上才能生长猕猴桃胚乳培养中，玉米素最好枣的胚乳培养中，激素似乎无特殊要求C、其他因素的影响蔗糖浓度：3%~5%温度：25℃pH值：如玉米6.1~7.0；苹果6.0~6.2等（三）培养方法：A、取授粉4-8d后的幼果，常规消毒B、无菌条件下切开果实，取出种子，分离出胚乳C、接种在培养基上，在25-27℃和黑暗条件或散射光下培养形成愈伤组织D、转到分化培养基上，待愈伤组织长出芽后，切下不定芽E、插入生根培养基中，光下培养10-15d，切口处长出白色的不定根※两种植物胚乳培养的方法A、枸杞开花20d的枸杞胚乳MS+2，4-D0.2mg/L生根MS分化出苗MS+BA0.2mg/L不同倍性的胚乳植株callusB、葡萄取出种子切去合点部分接种White+CM10%+2，4-D2.0+CH500+KT1.0+蔗糖3%~4%琼脂8%1个月，胚乳愈伤组织长大，胚解体未授粉胚珠和子房培养是离体受精的基础，可诱发大孢子发育成单倍体植株，且孤雌产生的单倍体植株获得率较孤雄生殖高。胚珠培养中，已授粉具有球形胚或更后期的胚珠易培养成种子，且培养基及添加成分相对要求不高。而受精不久的胚珠则需要成分复杂的培养基，培养难度大。

五、胚珠和子房培养1、胚珠培养的意义有利于合子和早期原胚的培养胚分化不全的种子的胚培养获得杂交后代和优良品种离体授粉的需要获得无病毒苗（一）胚珠培养不同植物的胚珠形态结构2、胚珠培养的方法长度小于3mm的胚珠，难与直接解剖，可先接种于液体培养基中，根据培养情况采取相应培养条件。（二）子房培养1、子房培养的意义

★有效地挽救杂种胚的败育★单倍体植株的培育★离体授粉的需要★离体条件形成果实★花被功能研究2、子房培养的方法授粉或授粉后的子房表面消毒接种培养受精后的子房仍需进行表面消毒后再接种。而未受精子房可将花被表面消毒后，在无菌条件下直接剥取子房接种。子房培养只需较简单的培养基即可形成果实，并含成熟种子。六、植物离体授粉受精离体受精技术的突破的技术前提：a、雌配子和雄配子分离技术b、单对原生质体融合技术c、微培养技术开花前数天套袋，开花前一天或当天取花蕾或花药，表面消毒后，无菌条件下收集花粉。采用直接引入法、注射法进行子房试管授粉，或者是采用哺育法、接近法进行胚珠试管授粉。1、离体受精方法胚珠花粉试管内授粉10d后胚珠培养3周后离体受精及植株再生过程2、技术关键A、花粉的采集和灭菌

★确定开花、花药分裂、授粉、花粉管进入胚珠和受精作用时间★去雄后将花蕾套袋隔离★采集花粉粒★消毒★无菌条件分裂花粉★授粉B、外植体选择★开花前套袋、去雄★开花后1~2d，采集花蕾，放入无菌室培养准备★切去柱头，防止不授粉★胚珠剥离时间（开花后1~2d效果好）C、适合的培养基离体受精的主要过程⊙花粉的萌发和花粉管的生长，受精⊙受精胚珠发育为成熟的种子，存在生活力的胚培养基应促进受精后的胚珠正常发育离体受精胚珠培养的改良Nitsch（1951）培养基配方成分数量（mg/L）成分数量（mg/L）成分数量（mg/L）Ca（NO3）24H2O500ZnSO47H2O0.5VB10.25KNO3125MnSO44H2O3.0VB60.25KH2PO4125H3BO30.5烟酸1.25MgSO47H2O125FeC6O5H75H2O10.0蔗糖50000CuSO45H2O0.025Gly7.5琼脂7000Na2MoO40.025泛酸钙0.25蔗糖浓度是4%~5%，水解酪蛋白为500mg/L，利于花粉萌发和种子发育3、离体受精障碍★花粉在柱头上不萌发★花粉管不能进入胚珠★花粉在花柱中破裂★受精后，胚和胚乳之间的不亲和性★受精后，胚乳发育不良★杂种胚不能发育成熟七、影响因素1、胚珠（子房）的成活率及育龄离体胚珠（子房）培养的成活率直接影响试管受精的成功率。胚珠（子房）离体成活率的关键是培养基成分的筛选。2、母体组织的影响柱头可影响某些植物受精，应切除柱头和花柱。而有些植物则需要保留，更有利于离体受精，如烟草。3、花粉萌发和花粉管生长离体花粉萌发率和花粉生长速度直接影响试管受精成功率。

胚龄胚长度（μm）营养需要（培养基营养）早球形胚后球形胚心形胚鱼雷胚成熟胚20~6061~8081~450451~700700（最大极限）小于40μm长的胚所需营养尚不清楚大量元素、微量元素、VB1、VB6、烟酸、糖2%、IAA0.1mg/L+KT0.01mg/L大量元素、微量元素、VB1、VB6、烟酸、糖2%Ca（NO3）2480mg/L、KNO363mg/L、KCl42mg/L、MgSO463mg/L、KH2PO442mg/L、VB1、VB6、烟酸、糖2%Ca（NO3）2480mg/L、KNO363mg/L、KCl42mg/L、MgSO463mg/L、糖2%荠菜不同发育时期胚培养的营养需要第二节人工种子一、人工种子的概念人工种子是指植物离体培养中产生的胚状体或不定芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中所形成的能发芽出苗的颗粒体。二、人工种子的类型及结构1、人工种子主要包括：a、裸露的或休眠的、经过或未经过干燥处理的繁殖体b、用聚氧乙烯等多聚体包裹的繁殖体c、用水凝胶包裹的繁殖体d、液胶包埋的、用流质播种法播种的体细胞胚2、人工种子的结构（1）胚状体（或芽）人工种子的胚主要是指体细胞胚，此外还有顶芽、腋芽、小鳞茎等也可以做为人工种子的胚。（2）人工种皮特点：

◆对胚状体或芽无毒害◆柔软且有一定机械抗压能力◆能保持一定水分及营养物◆允许种皮内外气体交换通畅◆不影响胚萌发突破◆播种后易于化解

目前人工种皮常选用的材料有藻酸盐等水凝胶、琼脂糖、角叉胶等。（3）人工胚乳

胚乳是胚胎发育的营养条件，因此人工胚乳的基本成分仍是胚发育所需各类营养成分，此外，还可根据需要添加激素、抗生素、农药等成分，以提高人工种子的抗性与品质。人工种子1、人工种子结构完整，体积小，便于贮藏与运输，可直接播种，易于机械化操作；2、不受季节限制，不受环境制约，胚状体数量多、繁殖快、有利于工厂化生产；三、人工种子的意义3、有利于繁殖生育周期长、自交不亲合、珍贵稀有的一些植物，也可大量繁殖无病毒材料；4、可在人工种子中加入抗生素、农药、菌肥等成分，提高种子活力和品质；5、体细胞胚由无性繁殖体系产生，可以固定杂种优势。四、人工种子技术1、胚状体诱导控制体细胞胚状体同步发育是制备人工种子的核心问题，可采取抑制剂法、低温法、渗透压法、通气法、分离过筛法等方法促进胚状体同步生长。2、人工种皮制作

早期的材料是聚氧乙烯，但有一定的毒性且遇水易溶解。后来采用藻酸盐较多，但易粘连、失水干缩，现在普遍采用在其外面加一层包裹剂如滑石粉、5%CaCO3等的方法来克服。3、人工胚乳的研制

人工胚乳主要包括无机盐、糖（或淀粉）、蛋白质等成分。对于无胚乳植物的人工种子制作必须加入糖分，同时也要加入防腐剂、抗菌素、农药等。4、包埋技术