第7章种质离体保存

第七章种质离体保存概述低温保存的细胞学基础保存中遗传变异的检测与利用影响保存效果的因素超低温保存的方法1几个相关概念（见《园艺植物育种学》）种质（germplasm）：决定生物的遗传性状，并将遗传信息从亲代传递给子代的遗传物质。种质资源包括动植物的个体、器官、组织、细胞甚至控制生物遗传性状的基因。种质库：又称基因库（GenBank），是以种为单位的群体中的全部遗传物质，它由许多不同基因型的个体所组成。种质资源（germplasmresource）或遗传资源（geneticresource）：具有种质并能繁殖的生物体。种质资源保存：为避免种质资源的流失，利用自然或人工创造的适宜环境，实现种质材料生活力的长期保持。2种质资源保存方法就地保存（自然保护区）迁地保存（种质圃保存）种子保存离体培养保存基因文库保存常温限制生长保存中低温调控生长保存低温干燥保存减压保存低温保存（低于-80℃）超低温保存（-196℃）难以长期保持种质寿命，对种质保存的作用不是很大。按保存条件（温度、含氧量等）按材料和方式3第一节概述一、植物种质资源低温保存的意义防止物种或品种灭绝节省人力物力便于种质资源的国内外交流4二、超低温保存的概念

低温保存（cryopreservation）是由cryo和preservation组成，在英语中cryo为一前缀，被解释为低温、冷、冰、霜之意。从词义看，低温所涉及的温度范围是不确定的。超低温:≤-80℃极低温:≤-70℃(干冰温度)低温:≤4℃

5但对植物而言，低温常常是指那些比常温稍低一些的温度。如果低温超过细胞原生质所能忍受的临界温度，就会致使植物细胞遭受冻害而死亡。如甜橙树发生冻害的临界温度通常在-6.5℃，枳壳通常在-20℃左右（沈德绪等，1986）。6低温保存（Cryopreservation），是指将植物的组织或细胞经过防冻处理后，在低于-80℃条件下保存的方法。超低温保存：将植物的组织或细胞经过防冻处理后，在-196℃的极端低温下保存的方法。7超低温保存的优点:在超低温条件下，活细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，呈现“假死”状态。因此，细胞、组织和器官在此过程中不会发生遗传性状的改变，也不会丢失形态发生的潜能。在超低温条件下，生命的代谢和衰老过程也基本停止，故能够实现长时期的保存。8超低温保存的意义:可以在有限空间内保存大量种质材料；与种子保存相比，可以不受时间和种子含水量的制约；与试管苗相比，可以避免频繁继代培养造成的变异，并大幅度减少工作量。9常用的超低温保存方法：冷冻诱导保护性脱水的超低温保存法玻璃化处理的超低温保存法10三、超低温保存的研究概况1．超低温保存技术的发展2．用于超低温保存的植物材料3．超低温保存的植物种类

据王君晖等1998年统计，有40多个属60多个种的木本植物已进行了超低温保存研究，其中：种子、胚、胚轴和胚的保存一般采用干冻法；茎尖和分生组织多采用玻璃化法或包埋脱水法；愈伤组织和悬浮细胞大多采用两步法。1112第二节植物材料超低温冻存的细胞学基础一、细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键

植物细胞中含有大量的水分，约占细胞总重量的60-90％。细胞中的水由游离水和束缚水组成，其中游离水约占90％，很容易冻结，由于细胞内含有许多化合物，因此细胞内溶液并不象纯水那样在0℃就结冰。131.细胞内外水分的冻结特性

理论上讲，细胞外水的冻结温度为-5～-15℃，细胞内游离水的冻结温度为-25℃，故在-30℃时，细胞内的游离水全部被冻结，而结合水则在-100℃温度下也不发生冻结。14根据Luyet的冻结理论（1937），细胞内游离水的冻结温度（-30℃）可认为是细胞冻存的安全温度，因而细胞冻存的两步冻结法一般以-30℃为基础的。也就是说，控制细胞内外水的冻结状态，是细胞冻存技术的关键。15超低温保存的原理为什么在超低温条件下材料不会冻死。关键原因是进行了“防冻处理”，具体如下：使用冷冻防护剂可以降低培养基和培养材料的冰点。使用冷冻防护剂可以提高培养基的渗透压，导致细胞发生轻微质壁分离，从而提高了组织和细胞的抗寒能力。16根据细胞内外水分的冻结特性，冻存方法有：分步冷冻：在细胞内游离水冻结之前，先使细胞外水分冻结，从而使细胞内游离水向胞外渗溢，导致细胞适度脱水，利于细胞的冷冻保存。快速冷冻：也称玻璃化冷冻保存技术，通过迅速降温，使细胞内水冻结产生的冰晶体积非常小，呈现为一种玻璃状的冻结现象，避免细胞受到伤害，达到细胞冷冻保存的目的。172.低温下细胞的致死损伤超低温保存的一般过程：超低温保存是建立在生物细胞冻害和抗冻机理的基础之上的。超低温保存成功的关键，在于降温过程中避免细胞内溶液结冰。为此，对于不同的植物种类或材料，应筛选相应的冰冻保护剂，采用适当的降温速度及化冻方式，才能使细胞不受损伤或损伤最小。预冻超低温长期保存解冻18第三节超低温保存的方法超低温保存的程序包括培养材料的准备、预处理、冰冻及保存、化冻处理、细胞活力测定、植株再生和变异评价等步骤。降温冰冻方法玻璃化保存方法超低温保存的方法19一、传统的降温冰冻方法1．慢冻法：以0.5-2℃/min速度降温至-100℃后投入液氮，或以该速度一直降温至-196℃后投入液氮。在冰冻保保护剂的作用下，既可避免在细胞脱水时细胞内产生冰晶，又能防止因溶质含量增加引起的“溶液效应”。因此，对于原生质体、悬浮培养细胞等细胞类型一致的培养物，这种方法效果最好。202．快冻法：将材料用玻璃瓶或锡箔纸袋保护后直接投入液氮或液氮的蒸气相中，该方法对高度脱水的材料如种子、花粉及抗寒性很强的休眠枝条或冬芽比较适宜，对含水量高的细胞培养物则不适合。213．分步冰冻法：是慢冻法和快冻法的结合，先用较慢的速度(0.5～4℃/min)降至-30～-40℃，停留0.5～1h，然后直接投入液氮中保存。停留的目的是诱导细胞外水分结冰，对细胞进行保护性脱水，避免细胞内产生非均一性冰晶。224.干冻法：将样品在高浓度(0.5-1.5M)渗透性化合物培养基上培养数小时至数天，再经过硅胶、无菌空气干燥脱水数小时(使含水量降至17～40％)或用藻酸盐包埋后投入液氮保存。该法特别适合于愈伤组织、体细胞胚、胚轴、胚、茎尖、生根苗保存，但不适用于脱水敏感的材料。23二、玻璃化保存方法玻璃化（vitrification）是指液体转变为非晶体玻璃态的固化过程。使溶液玻璃化有两条途径：一是大幅度提高冷却速率；二是增加溶液浓度。241.玻璃化法

玻璃化法是指将生物材料经高浓度玻璃化溶液快速脱水后，直接投入液氮，使材料连同玻璃化溶液同时转变成玻璃态。在此过程中，水分子没有发生重排，不形成冰晶，不发生结构和体积的改变，因而不会对材料造成机械损伤。当保存终止后，通过快速化冻防止去玻璃化的发生。如果材料能够安全度过冷却和化冻两个关口，冻存即告成功。252.包埋玻璃化法包埋玻璃化法是包埋脱水法和玻璃化法的结合。先把保存材料用藻酸钙包埋，再经蔗糖浓度梯度脱水和玻璃化溶液处理后投入液氮保存，其存活率比包埋脱水法要高，可能是因为藻酸钙的包埋减轻了玻璃化溶液的毒性。26包埋玻璃化的实例(a)将离体培养诱导的茎尖在黑暗和低温（4℃）条件下进行锻炼。(b)用海藻酸钙包埋茎尖。(c)将包埋体置于超净工作台上吹风干燥。(d)将包埋体在含0.75M蔗糖的培养基上预培养，进一步脱水。(e)将包埋体置于冷藏管中，投入液氮中保存。(f)快速化冻。(g)植株再生。27第四节

影响超低温保存效果的因素材料的基本特性冰冻保护剂的应用再生技术预培养与低温锻炼解冻方法28一、材料的基本特性材料的基本特性包括植物的基因型、抗冻性、器官、组织或细胞的年龄以及生理状态等（特别是基因型）。

植物细胞培养物的生长年龄，也是决定冻后细胞成活率的最重要因素之一。指数生长期和滞后期的幼龄细胞抗冻力强，存活率高。29二、预处理和低温锻炼预处理对于调整植物材料的生理状态非常有效，可以减少细胞内自由水含量，减轻冷冻伤害，提高抗冻能力。预处理措施:包括提高培养基的糖浓度、提高渗透压以减少细胞内自由水含量；在预培养基中添加诱导抗寒力的物质或冰冻保护剂，如0.3-1.0Ｍ蔗糖、甘露醇、山梨醇等渗透压调节剂，5-10％DMSO等冰冻保护剂。低温预培养：将材料于0℃以上低温、黑暗或弱光下离体培养几周，可明显增强其忍耐冷冻能力。30三、冰冻保护剂的应用冰冻保护剂（Cryoprotectiveagent，CPA）也称抗冻剂，为植物低温保存必不可少。特点：易溶于水，对细胞无毒害，容易从组织或细胞中清除。作用：增加膜透性，加速细胞内水流到细胞外结冰；稳定细胞膜结构，阻止低温伤害；降低冰点，提高溶液的粘滞性，阻止冰晶的生长。依据渗透性的有无，可将CPA分为两类：

渗透型非渗透型&31渗透型冰冻保护剂特点：多为中性低分子物质，在溶液中易与水分子结合发生水合作用，增加溶液的粘稠度，降低溶液的冰点，从而弱化了水结晶的过程，达到保护材料的目的。

种类：常用的有甘油、二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、乙酰胺、丙二醇（PG）。不同渗透型冰冻保护剂渗入细胞的能力及其对水分子活性的影响也有不同，如甘油适用于慢速冷却，DMSO容易渗入细胞，但有轻微毒性。32非渗透型冰冻保护剂特点：能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，在特定温度下能够降低溶质（电解质）浓度，从而起到保护作用。种类：主要有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖(Dextrane)、聚乙二醇(PEG)、白蛋白(Albumin)、羟乙基淀粉(HES)等。33四、解冻方法根据解冻速度分为快速解冻和慢速解冻两种方式：快速解冻：能使材料迅速通过冰融点的危险温度区(-50～-10℃)，防止降温过程中形成晶核对细胞造成损伤。通常的做法是把样品放入37～45℃温水浴中，待冰完全溶化后（约90s）立即移开。慢速解冻：对于脱水处理后干冻保存的材料，一般认为应先置于0℃下一段时间，再于室温下缓慢解冻效果较好。34另外，不同材料或方法采用的化冻方式也有不同：材料含水量：液泡小、含水量少的细胞（如茎尖分生组织），可采用快速化冻的方法；液泡大、含水量高的细胞则一般需要采用慢速化冻法。材料的生理状态：生长季节中的材料，一般在37～45℃温水浴中快速化冻（500-700℃/min）比在室温下慢速化冻要好，而木本植物的冬芽，在超低温保存后，必须在0℃低温下进行慢速化冻才能达到良好的效果。保存方法：玻璃化冻存的材料在保存终止后，要求快速化冻，以防止次生结冰对组织细胞造成伤害。351.冷冻保存后细胞和器官活力的检测再培养法测定存活率存活细胞(或器官)数目解冻(或器官)数目存活率=×100%五、培养及再生36经冻存的材料，不可避免地受到一些伤害，需要小心维护：培养:一般将材料培养在黑暗或弱光下培养1-2周，再转入正常光照下培养。

培养基:一般是保存前使用的培养基，但有时需将大量元素或琼脂含量减半，或在培养基中附加一定量的PVP、水解酪蛋白等，以利于材料的恢复生长。

2.培养及再生37六、超低温保存中变异及其检测保持原有种质的遗传稳定性，是种质保存的基本要求。超低温保存的遗传变异属于体细胞变异。变异与起始细胞的生理状态和培养基、预处理方式、解冻方式等有关（变异基本上都是在非超低温下产生的）。在保证保存材料活性的同时，应尽量采用减少变异的方法技术。38为了掌握超低温保存材料的遗传变异情况，有必要在保存材料的恢复和再生阶段建立有效的检测体系。目前，形态学观察、细胞学方法、同功酶、分子标记（如RFLP和RAPD）等检测方法常常单独或结合起来用于遗传变异分析。39种质超低温保存法程序示意图植物器官、组织和细胞细胞生长或植株再生再培养玻璃化冻存法分步冷冻法（两步法、多步冰冻法）加冷冻防护剂（0℃）快速冷冻法（降温速度1000℃/min）预处理（加速继代、提高培养基渗透压、低温锻炼）种质库（-196℃）迅速解冻（34-45℃）包埋干燥冷冻法40

植物种类参考文献白花三叶草（Trifoliumrepens）Yamadaetal.1991白薯（Ipomoeabatatas）

Towill1992百合（LiliumjaponicumThumb）Matsumoto1995,Sakai&Matsumoto1996菠萝（Ananascomosus）Gonzalez-Arnaoetal.1998薄荷(MenthaspicataL.)Hiraietal.1999茶（Camelliasinensis）Kuranuki&Sakai1994大麻（HumuluslupulusL.）Martínez1999大蒜（AlliumsativumL.）Niwataetal.1998豆荚树(Acaciamangium)Sudarmonowatietal.1998番木瓜（Caricapapaya）Towill1990甘蔗(BetavulgarisL.cloneSES1)Vandenbusscheetal.1998,柑橘（Poncirustrifoliate(L.)Raf.）Gonzalez-Arnaoetal.1998龙胆（GentianascabraBungevarbucrgcriMaxim.）SukaiandMatsumoto1996芦笋（Asparagusofficinalis）Uragamietal.1990,Kohmuraetal.1992陆生兰（Cymbidiumspp）Thinhetal.1998马铃薯（Solanumtuberosum）Fabre&Dereuddre1990猕猴桃（Actinidiadeliciosa）Suzukietal.1994苜蓿(MedicagosativaL.)Shiblietal2001苹果（Matusdomestica）Niinoetal.1992,Niino&Sakai1992,Pauletal2000葡萄（VitisvinifcraL.cv.chardonnay）Plessoaetal.1994桑树（Manihotesculenta）Niinoetal.1992山茱菜（Wasabiajaponica）Matsumonoetal.1994,Sakai&Mataumoto1996麝香石竹（Dianthuscaryophullus）Langisetal.1990,Towill1990柿(DiospyroskakiThunb.)Matsumotoetal.2001薯蓣(Dioscoreaspp)Mandal1995香蕉(Musaspp.)Helliotetal.2002杏（PrunusdulcisMill.）Shatnawietal.1998洋梨（Pyruscommunis）Niinoetal.1992,Dereuddreetal.1990,Niino&Sakai1992芋（Colocasiaesculenta(L.)schott）Takagietal.1997芸苔（Betavulgaris）Kohmuraetal.1992

玻璃化法和包埋脱水法保存植物茎尖文献一览表

41冷冻保存的应用前景1、长期保存种质的遗传稳定性。2、长期保存去病毒的种质。3、保持稀有珍贵及濒危植物的种质资源。4、保持不稳定性的培养物，如单倍体。5、保持培养细胞形态发生的能力。6、防止种质衰老。7、延长花粉寿命，解决不同开花期和异地植物杂交上的困难。8、冷冻解