第二章-分子克隆工具酶

2分子克隆工具酶概述限制性内切核酸酶甲基化酶（Methylase）DNA聚合酶（DNApolymeraseⅠ）其他分子克隆工具酶工具酶的定义o在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。o基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。o工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。o自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA进而降解非己DNA的防御工具。o本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。常用的工具酶o工具酶名称主要功能限制性核酸内切酶restrictionendonucleasesDNA连接酶DNAligase

在DNA分子内部的特异性的 碱基序列内部进行切割将两条以上的线性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯键连接成一个整体通过向3’端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链裂口，即5’→3’DNA聚合酶活性与3’→5’及5’→3’外切酶活性 催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的

5’－OH末端上 以RNA或DNA链为模板合成互补的cDNA链 将寡聚物尾巴加到了线性双链 或单链DNA分子的3’－OH末端或DNA的3’－末端DNA聚合酶IDNApolymeraseI多核苷酸激酶DNApolymerasekinease反转录酶reversetranscriptaseDNA末端转移酶DNAterminalDeoxynucleatidy

transferase

(接下表格)o常用的工具酶(续上表格)工具酶名称主要功能

去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基团 降解DNA3’－OH末端的核苷酸残基降解单链DNA或RNA,产生带5’磷酸的单核苷酸或寡聚核苷酸，同时也可切割双链核酸分子的单链降解双链DNA,RNA的5’及3’末端，高专一性单链核苷酸 能在高温（72℃）下的单链DNA为模板， 从5’→3’方向合成新生的互补链

专一性降解RNA

内切核酸酶，水解单链或双链DNA碱性磷酸酶BAPorCIP核酸外切酶IIIexonucleaseIII降解酶S1nucleaseS1核酸酶Bal31nucleaseBal31TaqDNA聚合酶TaqDNApolymerase核糖核酸酶RNase脱氧核糖核酸酶DNase2.1限制性内切酶(restrictionenzyme)ooooooooooo限制与修饰（Restrictionandmodification）限制酶识别的序列限制酶产生的末端DNA末端长度对限制酶切割的影响位点偏爱（Sitepreference）酶切反应条件星星活性（staractivity）单链DNA的切割酶切位点的引入影响酶活性的因素酶切位点在基因组中分布的不均一性Phageλ(k)（K菌株上生长的Phageλ）感染感染频率下降许多

E.colikE.coliB【E.coliB限制λ(k)】2.1.1限制与修饰（Restrictionandmodification）

1.限制与修饰现象

①50年代后Luria和Human(1952),Bertani

和

Weigle(1953)发现细菌的“限制”现象：E.coliB修饰λ(k)*λ(k)感染E.coli(B)细菌如何对λ噬菌体进行限制和修饰?②仍有少量λ(K)可在E.coliB中生存，是因E.coliB

对这些λ(K)进行了修饰。E.coli

菌株λ噬菌体感染率λKλBλCE.coli

K1

-410

-410E.coli

B

-4101

-410E.coli

C111表2-1λ噬菌体不同感染株对E.coli

不同菌株的感染率细菌的限制--修饰系统①1962年W.Arber(瑞士)发现，寄主对噬菌体的修饰是在λPhage的DNA上。②1965年，Arber发现修饰与λ的降解有关，提 出：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制-修饰系统(R-MRestriction-modificationsystem)。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤A成为N6甲基-腺膘呤，胞嘧啶C成为5’-甲基胞嘧啶。R-M系统是细菌安内御外的积极措施。2.限制性内切酶的发现•••1968年，Meselson从E.coli

K株中分离出了第一个限制酶EcoK，同年Linn和Aeber从E.coli

B株中分离到限制酶EcoB。1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限制性酶HindⅡ，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。HindⅡ限制性内切酶识别位点和切割位点如下：

5'…GTPy↓PuAC…3' 3'…CAPu↑PyTG…5'由宿主控制的限制与修饰作用

由修饰甲基转移酶和限制性核酸内切酶两种酶活性配合进行的

5’---------------GAATTC--------------3’

3’---------------CTTAAG---------------5’

EcoR

I限制作用

MEcoR

I修饰作用---G3’---CTTAA5’5’AATTC---3’

3’G----5’5’---GAATTC---3’3’---CTTAAG---5’

+EcoRIEcoRI与MEcoRI的限制与修饰作用机理限制性内切酶的命名o限制性酶采用三字母的命名原则，即属名+种名+株名的1个首字母，再加上序号，将限制性内切核酸酶的命名要点列于表。3-4个字母组成,方式是:属名+种名+株名+序号取属名的第1个字母,且大写取种名的第1个字母,小写①取种名的第2个字母,小写;②若种名有词头,且已命名过内切酶,则取词头后的第一字母代替若有株名,株名则作为第4字母,是否大小写,根据原来的情况而定若在同一菌株中分离了几个限制性内切核酸酶,则按先后顺序冠以I、II、III,.....等基本原则首字母第2字母第3字母第4字母顺序号限制性内切核酸酶的命名要点

要点

表条目Escherichia

ColiEcoRⅠRy13属名种类株系编号3.限制与修饰系统的种类o根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少可分为四类。o在已纯化分类的3000多种限制性内切酶中，已发现了超过250种的特异识别序列。ⅡⅠⅢ酶分子内切酶与甲基化酶分子不在一起三亚基双功能酶(R，M，S亚基)二亚基双功能酶识别位点4-6bp,大多数为回文对称结构非对称5-7bp非对称切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异性，至少在识别位点外1000bp在识别位点下游24-26bp限制反应与甲基化反应分开的反应互斥同时竞争限制作用是否需用ATPNoYesYes表2-2各种限制与修饰系统的比较Ⅱ型（typeⅡ）限制与修饰系统o限制酶：一般是同源二聚体（homodimer

），由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在DNA链的两个互补位点上。o修饰酶：单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成，分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。o它们识别回文对称序列（palindromesequence），在回文序列内部或附近切割DNA，产生带3'-羟基和5'-磷酸基团的DNA产物，需Mg2+，相应的修饰酶只需SAM。识别序列主要为4-6bp，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异。oⅡs型（typeⅡs）限制与修饰系统，占5%，与Ⅱ型具有相似的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为4-7bp，切割位点可能在识别位点一侧的20bp范围内。o其限制酶和甲基化酶（即R亚基和M亚基）各作为一个亚基存在于酶分子中，另外还有负责识别DNA序列的S亚基，分别由hsdR、hsdM

和hsdS

基因编码，属于同一操纵子（转录单位）。如EcoK

编码基因的结构为R2M2S,EcoB编码基因的结构为R2M4S2。oEcoB酶的识别位点如下，其中两条链中的A*为甲基化位点，N表示任意碱基。TGA*（N）8TGCToEcoK酶的识别位点如下，其中两条链中的A°为可能的甲基化位点。AA°C（N）6GTGCo但是EcoB酶和EcoK酶的切割位点在识别位点1000bp以外，且无特异性。Ⅰ型（typeⅠ）限制与修饰系统hsd:hostspecificityforDNArestrictionI类酶的作用方式(引自Lewin,1997)o在一定序列上识别DNA分子,并能同DNA分子作用,因其识别DNA后,要朝一个方向或两个方向移动一段距离(通常为1000个碱基左右)，并且要形成一个环才能切割DNA,所以识别位点和切割位点不一致，产生的片段较大。Ⅲ型（typeⅢ）限制与修饰系统o种类更少，所占比例不到1%，如EcoP1和EcoP15。它们的识别位点分别是AGACC和CAGCAG，切割位点则在下游24-26bp处。oEcoP1是由两个亚基组成，一个亚基(M亚基)负责位点识别和修饰。另一个亚基(R亚基)具有核酸酶的活性。切割DNA时需要ATP，Mg2+，也能被SAM激活，但并非必需。oⅢ类限制性内切核酸酶(引自Lewin,1997)2.1.2限制酶识别的序列1．限制酶识别序列的长度o限制酶识别序列的长度一般为4-8个碱基，最常见的为6个碱基。o当识别序列为4个和6个碱基时，它们可识别的序列在完

全随机的情况下，平均每256个和4096个碱基中会出现 一个识别位点（44

=256，46

=4096）。o注意：识别位点存在的概率不同！2．限制酶识别序列的结构o限制酶识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在

DNA两条链相对称的位置。o特例：（见下页举例）识别序列不是对称的识别多种序列识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意碱基。EcoRⅠG↓AATTCHindⅢA↓AGCTT

CTTAA↑GTTCGA↑A识别序列不是对称的AccBSⅠCCG↓CTCBssSⅠC↓TCGTG

GGC↑GAGGAGCA↑C识别多种序列AccⅠGT↓MKAC，M=A或C,K=G或T识别的序列呈间断对称AlwNⅠCAGNNNC↓TGDdeⅠC↓TNAGGT↑CNNNGACGANT↑C3．限制酶切割的位置o限制酶对DNA的切割位置大多数在内部，但也有在外部的。在外部的，又有两端、两侧和单侧之别。

2.1.3限制酶产生的末端1．限制酶产生匹配粘端（matchedend）o识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生 的末端为匹配黏端，亦即黏性末端（cohesiveend）。o若在对称轴5′侧切割底物，DNA双链交错断开产生5′

突出黏性末端；o若在3′侧切割，则产生3′突出黏性末端。NNG↓AATTCNNNNCTTAA↑GNNEcoRⅠ＋NNGNNCTTAAAATTCNN GNNPstI5’----NCTGCA↓GN----3’3’----NG↑ACGTCN----5’5’----NCTGCA3’----NG

GN----3’ACGTCN----5’＋2．限制酶产生平末端（Bluntend）o在回文对称轴上同时切割DNA的两条链，则产生 平末端，如HaeⅢ（GG↓CC）和EcoRV

（GAT↓ATC）。5’----NCCC↓GGGN----3’SmaI5’----NCCC+3’----NGGG↑CCCN----5’ CCCN----5’ GGGN----3’

3’----NGGG平末端o产生平末端的DNA可任意连接，但连接效率较黏 性末端低。3．限制酶产生非对称突出末端o当识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物的末端是不同的，如BbvCⅠ，它的识别切割位点如下：CC↓TCAGCGGAGT↑CGo有些限制酶识别简并序列，其识别的序列中有几种是非对称的。如AccⅠ，它的识别切割位点如下:GT↓AT/CGACCATA/GC↑TGo有些限制酶识别间隔序列，间隔区域的序列是任意的，如DraⅢ，识别切割位点是CAC↑NNN↓GTG。

4．同裂酶（isoschizomer）o识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可 能不同。①同序同切酶识别序列和切割位置都相同，如HpaⅡ与

MapⅠ识别切割位点为C↓CGG。②同序异切酶KpnⅠ和Acc65Ⅰ识别的序列是相同的，但切

割位点不同，分别为GGTAC↓C和G↓GTACC。③“同功多位”许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限 制酶的功能。如EcoRⅠ为G↓AATTC，ApoⅠ为R↓AATTY， 后者可识别前者的序列。④其他有些限制酶识别的序列有交叉，如在pUC系列质粒的多克隆位点（multiplecloningsite,MCS）中有一个SalⅠ位点（G↓TCGAC），该位点也可被AccⅠ（GT↓MKAC）和Hinc

Ⅱ（GTY↓RAC）切割。R=A,GY=C,T5．同尾酶o许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的，且 是对称的，即它们可产生相同的黏性突出末端。这些 酶统称为同尾酶（isocaudarner）。这些酶切割DNA

得到的产物可进行互补连接。oEcoRⅠG↓AATTCMfeⅠC↓AATTCoSpeⅠA↓CTAGTNheⅠG↓CTAGCXbaⅠT↓CTAGAoBamHⅠG↓GATCCBglⅡA↓GATCTSau3AⅠ/MboⅠ↓GATC

MunI：5`-CAATTG-3` 3`-GTTAAC-5`EcoRI：5`-GAATTC-3` 3`-CTTAAG-5`5`-CAATTG-3`3`-GTTAAC-5`5`-GAATTC-3`3`-CTTAAG-5`重新连接后的序列：5`-CAATTC-3`3`-GTTAAG-5`同尾酶（isocaudamer

）用途6．归位内切酶(了解）o有些线粒体、叶绿体、核DNA、T偶数噬菌体含 有一些编码内切酶的内含子，有些内含肽 （intein，蛋白质剪切的产物）也有内切酶的 活性。o这两类内切核酸酶称为I-prefix和PI-prefix系 列内切酶，它们识别的序列很长。I-prefix系 列酶是由在RNA水平上剪切的产物编码的，PI- prefix系列酶是在蛋白质水平上剪切的产物。o这类内切酶也称为归位内切酶（homing

endonuclease）。2.1.4DNA末端长度对限制酶切割的影响o限制酶切割

DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。o不同的酶对识别序列两端的长度有不同的要求,见表2-4。o在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切割扩增的PCR产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。限制酶待测的寡核苷酸序列酶切活性2h20hAccⅠCCGGTCGACCGG00Hin

dⅢCAAGCTTG00CCAAGCTTGG00CCCAAGCTTGGG1075EcoRⅠGGAATTCC＞90＞90PstⅠGCTGCAGC00TGCACTGCAGTGCA1010AACTGCAG（N）14＞90＞90CTGCAG（N）2000表2-4靠近DNA片段末端的切割效率（%）限制性内切酶的活性单位o可用酶单位（unit）来描述其量的多少。o1个单位酶是指在建议使用的缓冲液及温度下，在20μl

反应液中反应1h，使1μgDNA完全消化所需的酶量。应该记的缩写：Tris:三羟甲基氨基甲烷BSA:牛血清白蛋白DTT:二硫苏糖醇DMSO:二甲基亚砜o在双酶切多克隆位点时选择酶切秩序。o在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切割扩增的PCR产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。2.1.5位点偏爱某些限制酶对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割，即对 不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率，这种 现象称作位点偏爱（sitepreference）。oEcoRⅠ酶切割λ噬菌体DNA中的5个位点时并不是随机的，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快10倍；2.1.6酶切反应条件1．缓冲液o常规缓冲液一般包括提供稳定pH值的缓冲剂、Mg2+、DTT（二硫苏糖醇）以及BSA（牛血清白蛋白）。opH7.0-7.9（在25℃时）；oMg2+作为酶的活性中心，由MgCl

2或乙酸镁提供；浓度常为10mmol/L；DTT浓度常为1mmol/L。o有时缓冲液中还要加入100µg/mlBSA。o不同的酶对离子强度的要求差异很大，据此可将将限制酶缓冲液按离子强度的差异分为高、中、低3种类型，离子强度以NaCl来满足，浓度分别为100mmol/L、50mmol/L和0mmol/L。酶标准缓冲液中的NaCl浓度 ／（mmol／L）限制酶的活性0.5×1×2×EcoRⅠ10050-7575-100100HindⅢ5025-50100100HincⅡ100100100100KpnⅠ010010025-50PstⅠ10075100100SAlⅠ100﹤25﹤25100ApaⅠ010010025-50表2-5标准缓冲液中的NaCl浓度和限制酶的活性2．反应温度o反应温度大多数为37℃，一部分为50-65℃，少数25-30℃。o高温作用酶在37℃下的活性会下降，多数仅为最适条件下的10-50%。如TaqⅠ限制酶（正常反应温度为65℃），在37℃只有在65℃活性的10%；ApoⅠ（正常反应温度为50℃），37℃只有在50℃时活性的50%。o销售商在产品说明中都会标明最佳反应温度。3．反应时间o反应时间通常为1h或更多，许多酶延长反应时间可减少酶的用量。oEcoRⅠ若反应16h，所需酶量为正常酶切时间的1/8，即若反应时间为16h，则所用酶量为只切1h的1/8。o其他一些酶也有类似情况，如HindⅢ为1/8；KpnⅠ为1/4；BamHⅠ为1/2。4．终止酶切的方法oEDTA可螯合镁离子，从而可终止酶切反应，终止浓度为10mmol/L；o加热是常用的方法，对于最佳反应温度为37℃的酶，在65℃或80℃处理20min可使酶活性大部分丧失。o对于在80℃作用20min也有不失活的酶，如最佳反应温度为37℃的酶BglⅡ、HpaⅠ和PvuⅡ，65℃酶Tth111Ⅰ和TspRⅠ，以及50℃酶Bc1Ⅰ，可用苯酚抽提去除蛋白，或用试剂盒纯化DNA。Ⅱ型核酸内切酶的多酶联合酶解对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：

(1)使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解；(2)低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切；(3)一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切。2.2甲基化酶（Methylase）2.2.1甲基化酶的种类o在真核和原核生物中存在大量的甲基化酶（methylase）。o原核生物甲基化酶作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。1．Dam甲基化酶oDam可在GATC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。o有些限制酶对Dam甲基化的DNA敏感，不能切割相应的序列，如BclⅠ、ClaⅠ和XbaⅠ等。o对甲基化不敏感的有BamHⅠ、Sau3AⅠ、BalⅡ和PvuⅠ等。MboⅠ和Sau3AⅠ识别和切割位点相同，但其差异就在于前者对甲基化敏感。2．Dcm甲基化酶oDcm识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个胞嘧啶C的C5位置上引入甲基。o受Dcm甲基化作用影响的酶有Acc65Ⅰ、AlwNⅠ、ApaⅠ、EcoRⅡ和EaeⅠ等。o不受此甲基化影响酶有BanⅡ、Bg1Ⅰ、BstNⅠ、KpnⅠ和NarⅠ等。3．EcoKⅠ甲基化酶oEcoKⅠ甲基化酶的识别位点少，识别AAC（N）6GTGC和GCAC（N）6GTT序列中A的N6位置。4．SssⅠ甲基化酶oSssⅠ甲基化酶来自原核生物（Spiroplasmasp.），可使CG序列中的C在C5位置上甲基化。o甲基化的模板可以是甲基化或半甲基化链（新合成链）的DNA链。o许多酶对此甲基化敏感，如AatⅡ、ClaⅠ、XhoⅠ、SalⅠ等，也有不敏感的，如BamHⅠ、EcoRⅠ、SphⅠ和KpnⅠ。2.2.2依赖于甲基化的限制系统oE.coli有3种依赖于甲基化的限制系统McrA、McrBC和Mrr，只识别经过甲基化的序列，都限制由CG甲基化酶（M.SssⅠ）作用的DNA（限制即消化降解）。oMrr限制m6A；McrA限制HpaⅡ甲基化修饰的位点；McrBC切割（G/A）m5C；o大多数常用的E.coli都含这三个限制系统中的1个或几个。2.2.3甲基化对限制酶切的影响1．修饰酶切位点oHincⅡ可识别四个位点（GTCGAC、GTCAAC、GTTGAC和GTTAAC），甲基化酶M.TaqⅠ可甲基化TCGA中的A，所以M.TaqⅠ处理DNA后，GTCGAC将不受HincⅡ切割。oM.MspⅠ修饰的产物为m5CCGG，在BamHⅠ识别位点（GGATCC）前面如果为CC或后面为GG，那么经M.MspⅠ处理的DNA（GGATm5CCGG）对BamHⅠ不敏感（即抵抗切割）。2．产生新的酶切位点o通过甲基化修饰可产生新的酶切位点。DpnⅠ是依赖甲基化的限制酶，TCGATCGA受M.TaqⅠ处理后形成甲基化（A）产物TCG*ATCG*A，其中G*ATC即为DpnⅠ位点。3．对基因组作图的影响o利用限制酶对甲基化的敏感性差异研究哺乳动物m5CG、植物m5CG和m5CNG、肠道细胞Gm6ATC的甲基化水平和分布。TCGA甲基化TCGAm6

TCGA+TCGA

或DNA中的TCGATCGA序列连接酶

TCGATCGA

M.TaqITCGAm6TCGAm6DpnI切点③构建新的酶切位点① ②DpnI是唯一识别GAm6TC的限制酶，而不降解GATC。

M.TaqI可使M.RECH3RERERERERERECH3与载体相连RE

甲基 化酶

RERE

人工 接头CH3RE

RE用于基因组文库的建立用于cDNA

的连接

RERE

RE CH3CH3RECH32.3DNA聚合酶（DNApolymeraseⅠ）o主要活性是催化DNA的合成（在有模板，引物，dNTP等的情况下）及其相辅的活性。o原核细胞有3种DNA聚合酶，都与DNA链的延长有关。聚合酶Ⅰ是单链多肽，可催化单链或双链DNA的延长；聚合酶Ⅱ则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；聚合酶Ⅲ在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。基因工程研究中常用的聚合酶聚合酶类：大肠杆菌DNA聚合酶I

大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow酶

T4DNA聚合酶

T7DNA聚合酶修饰的T7DNA聚合酶TaqDNA聚合酶反转录酶作用：在DNA模板链上将dNMP连续地加到双链DNA分子引物链的3-OH末端，催化合成以模板互补的DNA序列共同特点：具有催化核苷酸聚合能力，但在外切酶活性，聚合速率等方面各有差别。DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持续合成能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中TaqDNA聚合酶无有快高常用DNA聚合酶的特性比较2.3.1大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（E.coliDNApolymeraseⅠ）1．E.coli

DNA聚合酶Ⅰ的活性oE.coli

DNA聚合酶Ⅰ为单链多肽（109kDa），有3种活性。①5‘--3’DNA聚合酶活性反应底物为单链DNA及引物（带3‘-OH基）或5’突出的双链DNA。Mg++,dNTPDNA聚合酶Ⅰ②5‘--3'外切核酸酶活性o反应底物是双链DNA或DNA:RNA杂交体，它可从5‘端降解双链DNA，也降解RNA:DNA中的RNA（RNaseH活性）。Mg++,dNTPDNA聚合酶Ⅰ

③3'--5'外切酶活性o反应底物是带3‘-OH的双链DNA或单链DNA，其活性从

3’-OH端降解DNA，可被5‘--3’聚合活性封闭，也可被 带5‘磷酸的dNMP所抑制。

Mg++DNA聚合酶ⅠMg++,dNTP DNA聚合酶Ⅰo3’-5’外切酶活性与DNA聚合酶的校正功能有关。④交换（置换）反应o如果只有一种dNTP存在，3‘--5’外切活性将从3‘-OH端

降解DNA，然后在该位置发生一系列连续的合成和外切反 应，直到露出与该dNTP互补的碱基。o总之，在没有dNTP

的情况下，外切活性占主导地位，而 当存在足够的dNTP

时，外切活性和合成活性将处在动态 平衡中，结果使得双链DNA成为平末端。2．E.coli

DNA聚合酶Ⅰ的用途①切口平移法（nicktranslation）标记DNA②用于cDNA

克隆中的第二链，即单纯的DNA聚合活性。但由于具有5‘--3’外切活性，现在已不再使用，而改用Klenow

酶和反转录酶（详见后文）。③对3'突出端的DNA作末端标记（交换或置换反 应），但是此反应用T4或T7DNA聚合酶效果会更好 （详见后文）。交换或置换反应2.3.2KlenowDNA聚合酶oKlenowDNA聚合酶是从全酶中除去5′―3′外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和3′―5′外切活性不受影响。也称为Klenow片段（Klenow

frgment），或E.coli

DNA聚合酶Ⅰ大片段（E.coli

DNApolymeraseⅠlargefragment）。o它也可以通过基因工程得到，分子量为76kDa。o由于没有5′―3′外切活性，使用范围进一步扩大。用途①补平3′凹端DNA使用单纯的DNA合成活性。注意要 加足够的dNTP；如果使用带标记的dNTP，则可对DNA

进行末端标记。②抹平DNA3′凸端在3′―5′外切活性作用下，可切除突出的3′凸端。③通过置换反应对DNA进行末端标记该作用已经被T4

或T7DNA聚合酶代替；它还可以在补平3′凹端的过 程中进行标记。④在cDNA克隆中合成第二链⑤随机引物标记⑥应用于Sanger双脱氧链末端终止法的DNA测序（被T7DNA聚合酶取代）⑦应用于PCR反应，被Taq

DNA聚合酶等取代⑧在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA2.3.3T4噬菌体DNA聚合酶（T4phageDNApolymerase）oT4噬菌体DNA聚合酶来源于T4噬菌体感染的E.coli，分子量为114kDa。o与Klenow酶活性相比有如下几个特点：①外切酶活性对单链比对双链更强，比Klenow强100-1000倍。酶活性.可用替代/置换合成法标记探针。③补平或标记3’末端凹陷的DNA分子DNA片段的同位素末端标记5’G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3’C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5’

5’G-C-T-CA-G-C-T-G-OHHO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5’T4-DNApolMg2+5’ppp

dN

5’pppdA（a-32P-dATP）T4-DNApol5’G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3’C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5’2.3.4T7噬菌体DNA聚合酶（T7phageDNApolymerae）蛋白质复合体，一种是噬菌体基因5蛋白，另一个是宿主蛋白的硫氧还蛋白。o是所有DNA聚合酶中持续合成能力最强的一个，产物平均长度大，在测定核苷酸序列时有优势。o活性与T4噬菌体DNA聚合酶和KlenowDNA聚合酶类

似，但3′―5′外切活性为Klenow的1000倍。o可替代T4的功能并可用于长模板的引物延伸。商品化的测序酶oSequenase（测序酶）：美国UnitedStatesBiochemical公司改造的T7噬菌体DNA聚合酶，切除了99%以上的3′―5′外切活性。oSequenaseVersion2：切除了所有的3′―5′外切活性，是用双脱氧链终止法对长片段进行测序的理想用酶。2.3.5耐热DNA聚合酶o耐热DNA聚合酶在高温下有DNA聚合活性，来自噬高温的细菌，主要用于PCR反应，如Taq

DNA聚合酶、VentDNA聚合酶、Pfu

DNA聚合酶、Pwo

DNA聚合酶和Tth

DNA聚合酶等。oAMV逆转录酶分子量为1.6×105dal,由α、β两种亚基组成，具有5’→3’聚合作用的反转录酶活性和

RNaseH活性，这种酶又称依赖于RNA的DNA聚合酶。oM-MuLV反转录酶是单链多肽，84kDa，其RNAseH活性弱，有利于合成较长cDNA。其基因工程产品纯度高。2.3.6反转录酶（reversetranscriptase）有两种反转录酶已经商品化：一种来自禽成髓细胞瘤病毒(AMV)；另一种是鼠白血病病毒(Mo-MLV)基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-18反转录酶Mg2+

dNTP3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNA双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链反转录酶3’RNA5’DNA3’5’3’RNA5’DNA3’5’反转录酶5’DNA3’o用途:1.可以mRNA为模板合成单链cDNA；2.也可以单链cDNA为模板合成双链DNA；3.还可利用单链DNA或RNA作模板合成分子探针。这是分离真核生物基因制备cDNA文库常用的方法。探针可用于检测DNA或RNA。2.3.7末端转移酶（terminaltransferase）o是一种不依赖于模板的DNA聚合酶。①合成方向5’→3’②合成时不要模板，但底物至少要3个核苷酸，③对dNTP非特异性，任一种都可以作底物，④可催化3’－OH末端单链或3’－OH突出的双链，需要Mg++或Mn++，⑤用Co++代替Mg++作辅助因子，可在平末端DNA分子上进行末端转移。pmol3′-OH:µM

dNTPdAdCdGdT1:0.11～101～51～51～101:1.510～3010～3010～2010～351:3.0100～

200100～

20015～35200～

2501:15400～

500400～

50015～35300～

400表2-6末端转移酶形成的同聚尾的长度①给载体或cDNA加上互补同聚物尾，

②标记DNA片段的3’－OH端，可用α－32P－dNTP也可催化非放射性标记物参入DNA3’－末端，③合成多聚脱氧核苷酸同聚物。用途2.4其他分子克隆工具酶2.4.1依赖于DNA的RNA聚合酶（DNA dependentRNApolymerase）o依赖于DNA的RNA聚合酶包括SP6噬菌体RNA聚合酶和T4

或T7噬菌体RNA聚合酶。1．活性o转录中的RNA合成酶，识别DNA中各自特异的启动子序 列，并沿此dsDNA模板起始RNA的合成。它与DNA聚合酶 不同，无需引物，但需识别特异性位点。2．用途①体外合成RNA分子。②用于表达外源基因。2.4.2连接酶（ligase

）DNA连接酶的基本反应特性o催化双链DNA切口处的5'-磷酸和3'-羟基生成磷酸二酯键o连接反应需要供给能量。大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶以NAD+作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。DNA连接酶的作用机理1．T4DNA连接酶（T4DNAligase）oT4DNA连接酶的分子量为68kDa，催化DNA5′磷酸基与3′羟基之间形成磷酸二酯键。反应底物为粘端、切口、平端的RNA（但效率低）或DNA。低浓度的聚乙二醇PEG（一般为10%）和单价阳离子（150-200mM

NaCl）可以提高平端连接速率。o连接反应条件需要ATP，若在16℃反应，大约需4小时；若在4℃反应，则需反应过夜。2．E.coliDNA连接酶（E.coli

DNAligase）o与T4DNAligase活性相似，但需NAD+参与，且其平端连接效率低，常用于置换合成法合成cDNA。作cDNA克隆时，不会将RNA连接到DNA，不连接RNA。3．Taq

DNA连接酶oTaq

DNA连接酶可在两个寡核苷酸之间进行连接反应，同时必须与另一DNA链形成杂交体，相当于连接dsDNA中的缺口，作用在45℃-65℃，需NAD+。TDNAligase

4E.coliDNA

ligase来源T噬菌体

4大肠杆菌分子量68,00075,000辅助因子ATP

+NAD底物1.双链DNA分子的粘,平端2.RNA-DNA杂和体,RNA链缺口3.双链DNA中的单链缺口同源互补粘端 双链分子中的单链 缺口应用范围广泛，效率高窄影响连接反应的因素1．反应时间与温度：连接酶最适的反应温度应是37℃，但 在这一温度下粘性末端的氢键结合不稳定，因此连接反 应常采用的最佳温度一般在4-16℃间，通常多选用12- 16℃30分钟到16小时。2．连接酶的用量：粘性末端DNA连接的酶用量在0.1单位时 就可以达到最佳的连接效果，而平端DNA连接所需酶的 至少需要提高10-20倍。3．DNA底物的浓度：一般情况下对于连接200-500bp的外源DNA连接体积在0.1-0.3ug/10ul。插入片段:载体分子的摩尔比为3:1为较好。4．其他干扰因素：EDTA，杂蛋白质，存留有活性的酶等影响酶切的因素也影响连接。4．T4RNA连接酶oT4RNA连接酶可以催化单链DNA或RNA的5′-磷酸与另一单链DNA或RNA的3′羟基之间形成共价连接。o可用于标记RNA的3′末端、单链DNA或RNA的连接、增强T4DNA连接酶的连接活性以及合成寡核苷酸。2.4.3T4多核苷酸激酶（T4polynucleotidekinase）o该酶催化γ－磷酸从ATP分子转移给DNA或RNA分子的5’－OH末端。o可分为正向反应和交换反应标记法。o用途:该酶主要用于对缺乏5′-磷酸的DNA或合成接头进行磷酸化,同时可对末端进行标记。正向反应：+r-32P-ATP+ADP5’OHDNA---- or5’OHRNA----

Mg++T4kinase5’[32P]DNA or 5’[32P]RNA交换反应：反应物中r-32P-ATP和ADP超量时，该酶就会催化DNA分子末端发 生交换+r-32P-ATP+ADP5’PDNA or5’PRNA

Mg++T4Kinase5’[32P]DNA or5’[32P]RNA+ATP+ADP2.4.4碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）o来源:牛小肠碱性磷酸酶（Calfintestnalalkalinephosphatase），简称CIP或CIAP， 细菌的碱性磷酸酶（bacterialalkalinephosphatase,BAP）虾的碱性磷酸酶（shrimpalkalinephosphatase,SAP）。o均能催化除去DNA或RNA5′磷酸的反应。o通过去除5′磷酸基团，可用于防止DNA片段自身连接，或标记（5′端）前除DNA或RNA5′磷酸。碱性磷酸酶活性2.4.5核酸酶（nuclease）1．BAL31核酸酶（BAL31nuclease）o来源:交替单胞菌（alteromonas

espejiana）BAL31o主要活性:3′外切核酸酶活性，可从线性DNA

两条链的3′端迅速去除单核苷酸，随后可从单 链DNA内部发挥缓慢的内切酶活性，形成截短 了的平端双链DNA分子（约占10-20%）以及带 有约5个核苷酸突出单链的截短分子（约占80- 90%）。对于所形成的单链突出，可用DNA聚 合酶补平。2．Sl核酸酶（S1nuclease）o来源:米曲霉（

aspergillus

oryzae）o作用方式:降解单链DNA和RNA，包括双链分 子中的单链区，产生5’－磷酸化单核苷酸或寡核苷酸。

对于双链DNA或RNA以及DNA：RNA杂合链 的作用相对较低但大大提高酶量也可降解双链

DNA，特别对是有切口或缺口的双链DNA。o用途:用于分析DNA:RNA杂交体的结构，给

RNA分子定位，证明基因内部内含子的存在;

去掉双链核酸中突出的单链尾从而产生平末端;打开双链cDNA合成中产生的发荚环。3．绿豆核酸酶（mungbeannuclease）o来源于绿豆芽，与Sl酶相似，但比Sl酶更温和。在大切口上才切割，更容易使双链DNA突出端变成平端。4．核糖核酸酶A（ribonucleaseA或RNaseA）o来源于牛胰，为内切核酸酶，可特异攻击RNA上嘧啶残基的3′端。可除去DNA:RNA中未杂交的RNA区，可用来确定DNA或RNA中单碱基突变的位置。广泛用来去除DNA样品中的RNA。5．脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）o来源:牛胰，是内切核酸酶，可优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA。在Mg2+存在下，独立作用于每条DNA链，且切割位点随机。在Mn2+存在下，它可在两条链的大致同一位置切割dsDNA，产生平端或1-2个核苷酸突出的DNA片段。o用途:切口平移标记时在dsDNA上随机产生切口；在闭环DNA上引入单切口，以将分子截短（在亚硫酸氧盐介导的诱变前）；建立随机缺失的嵌套缺失体，用于功能分析或测序；在DNA酶足迹法（DNAfootprinting）中分析蛋白:DNA复合物；除去RNA样品中的DNA。6．外切核酸酶Ⅲ（exonuleaseⅢ）o大肠杆菌外切核酸酶Ⅲ催化从dsDNA3′-OH逐一去除单

核苷酸的反应，底物为dsDNA或线状和带切口或缺口的 环状DNA，反应结果是在dsDNA上产生长长的单链区。o该酶还有对无嘌呤DNA特异性内切核酸酶活性、RNaseH活性和3′-磷酸酶活性（去磷酸）。o但不降解核酸内的磷酸二酯键，也不降解单链DNA及带3′突出的dsDNA。o该酶持续作用能力不强，产物为切割程度不相上下的群体，有利于分离长短不等的DNA。7．核糖核酸酶H（ribonucleaseH或RNaseH）o性质:内切核酸酶，特异性水解与DNA杂交的RN