第六章酶工程

酶和细胞的固定化定义酶的固定化细胞的固定化应用固定化酶

是指在一定空间内呈闭锁状态的酶，能连续的进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。固定化酶的特点可以多次使用，稳定性提高易于提纯，产品质量高易于控制，实现连续化和自动化控制酶利用率高比水溶性酶更适于多酶反应酶的固定化载体结合法

将酶固定到非水溶性载体上的方法。根据固定方式的不同，这种方法又可以分为物理吸附法、离子结合法和共价结合法。交联法

通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法。交联法使用的交联剂是戊二醛等水溶性化合物。

包埋法

将酶包裹在多孔的载体中

一、吸附法

物理吸附法静止法电沉积法反应器上直接吸附法混合浴或振荡浴吸附法优点： 固定化时酶分子的构象很少 或基本不发生变化。缺点： 结合力弱，易解吸附。载体： 纤维素、琼脂糖、活性炭、 沸石及硅胶等。离子结合法含有离子交换基团的固相载体第一个离子结合法固定化酶：

DEAE—Cellulose

固定化过氧化氢酶第一个工业化的固定化酶：

DEAE-SephadexA-50

固定化氨基酰化酶二、包埋法凝胶包埋法首先被采用的凝胶包埋法是：固定化胰蛋白酶木瓜蛋白酶

－淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉双丙稀酰胺,丙稀酰胺引发剂－－inactiation包埋法—微胶囊法常用材料：聚酰胺膜火棉胶硝化纤维聚苯乙烯壳聚糖等微胶囊固定化酶制备方法界面聚合法

将酶水溶液和亲水单体用一种与水不溶的有机溶剂制成乳化液，再将溶于同一种有机溶剂的疏水单体溶液边搅拌边加入到上述乳化液中，在乳化液中的水相和有机相之间的界面发生聚合作用，酶即被包埋于聚合体膜中。液体干燥法

将一种聚合物溶于一种沸点低于水且与水不溶的有机溶剂中，加入酶的水溶液，以油溶性表面活化剂，制成第一乳液。把它分散于含有保护性胶质、聚丙烯醇和表面活性剂，形成第二乳液。在不断搅拌、低温和真空条件下蒸出有机溶剂，得到含酶微胶囊。其他方法脂质体包埋法、纤维包埋法等三、共价交联法双功能试剂：常用的是戊二醛

O

O H—C—CH2—CH2—

CH2—

C—H第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间交联的固定化酶酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶（四）共价偶联法细胞的固定化优越性

保持了胞内酶系的原有状态和天然环境，因而更稳定。局限性（1）利用的仅是胞内酶，且副产物多（2）细胞膜、细胞壁和载体存在扩散限制作用（3）载体孔隙的大小影响高分子底物的通透性酶的人工模拟一、模拟酶的概念和理论基础二、模拟酶的分类和制备三、印迹酶一．模拟酶的概念和理论基础概念根据酶的作用原理，用各种方法认为制造的具有酶性质的催化剂，简称人工酶活模拟酶模拟酶的理论基础模拟酶的酶学基础：主-客体化学和超分子化学1.模拟酶的模拟酶的酶学基础

过渡态理论对简化的人工体系中识别、结合和催化的研究2.主-客体化学和超分子化学主-客体化学：主体和客体在结合部位的空间及电子排列的互补超分子：该分子形成源于底物和受体的结合，这种结合基于非共价键相互作用，当接受体与络合离子或分子结合形成稳定的，具有稳定结构和性质的实体，形成超分子功能：分子识别、催化、选择性输出二．设计要点设计前：酶活性中心-底物复合物的结构酶的专一性及其同底物结合方式反应的动力学及各中间物的知识设计中：为底物提供良好的微环境催化基团必须相对于结合点尽可能同底物的功能团相接近应具有足够的水溶性，并在接近生理条件下保持其催化活性三、模拟酶的分类分类依据

Kirby分类法按照模拟酶的属性Kirby分类法单纯酶模型机理酶模型单纯合成的酶样化合物1.Kirby分类法单纯酶模型：

化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性机理酶模型：

通过对酶作用机制诸如识别、结合和过渡态稳定化的认识，来指导酶模型的设计和合成单纯合成的酶样化合物

化学合成的具有酶样催化活性的简单分子2.按照模拟酶的属性主-客体酶模型胶束酶模型肽酶抗体酶分子印迹酶模型半合成酶2．环糊精结构示意胶束酶模型第三节印迹酶一分子印迹技术概述二分子印迹酶分子印迹酶1．分子印迹概念：制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程2.分子印迹技术内容选定印迹分子和功能单体，使二者发生互补反应在印迹分子-单体复合物周围发生聚合反应用抽提法从聚合物中除掉印迹分子3．分子印迹酶通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合作用，并可以在结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并与底物定向排列。性质：遵循米氏方程，催化活力依赖反应速度常数。生物印迹生物印迹：指以天然的生物材料，如蛋白质和糖类物质为骨架，在其上进行分子印迹而产生对印迹分子具有特异性识别空腔的过程。非水相生物印迹酶制备示意图抗体酶一、抗体酶的概念二、抗体酶的催化特征三、抗体酶的催化作用机理四、抗体酶的催化反应类型五、抗体酶的制备方法六、抗体酶的应用抗体酶的概念抗体酶或催化抗体（Catalyticantibody)是一种新型人工酶制剂，是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。二、抗体酶的催化特征1.与天然酶相比抗体酶的特点能催化一些天然酶不能催化的反应有更强的专一性和稳定性催化作用机制不同2.抗体酶和非催化性抗体作用的比较更高的反应特异性反应的可逆性反应的量效性反应过程三、抗体酶的催化作用机理1、过渡态理论与抗体酶2、抗体酶催化的三种重要反应机制水解作用机制基团转移连续反应机制3、抗体酶催化反应的介质效应酯解反应中介质效应：抗体酶在有机溶剂中具稳定性。脱羧反应中介质效应：有机溶剂引起脱羧反应速率增加。酰基转移反应中介质效应：在疏水溶剂中，活性较高。三、抗体酶的催化反应类型1.转酰基反应2.水解反应3.Claisen重排反应4.酰胺合成反应5.Diels-Alder反应6.转酯反应7.光诱导反应8.氧化还原反应9.脱羧反应10.顺反异构化反应四、抗体酶的制备1.细胞融合法：用设计好的半抗原，通过间隔链与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后对此抗原进行免疫，使宿主有机体针对抗原产生抗体，产生抗体的脾脏细胞与骨髓细胞相融合。融合得到的杂交细胞既能产生抗体又能在体外培养。将杂交体克隆化，即能产生单一均匀的抗体。2.抗体结合位点化学修饰法：抗体酶和酶一样也可以用化学修饰法加以改造。对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和的方法在抗体结合位置或附近引入具有催化功能的基因。游离巯基就是适合的基团之一，它具有高亲核性，易于氧化，及能通过二硫化物进行交换反应或亲电反应而选择性修饰的特点。3.引入辅助因子法

很多天然酶活性中心都含有金属离子。Lerner等将金属离子引入抗体酶，成功地催化了肽键的选择性水解。他们用三乙撑胺Co3+盐作为金属离子辅因子，所用半抗原分子带有一肽键。且通过羧根及仲胺基与金属离子相连。将此半抗原通过共价键连接在载体蛋白免疫动物产生的抗体，在金属离子复合物作为辅因子的参与下，这些抗体酶能选择性水解甘氨酸和丙氨酸之间的肽键.4.抗体库法用基因克隆技术将全套抗体重链和轻链可变区基因克隆出来，重组到原核表达载体，通过大肠杆菌直接表达有功能的抗体片段，从中筛选特异性的可变区基因抗原和抗体

当外源物性物质，如蛋白质、毒素、糖蛋白、脂蛋白、核酸、多糖、颗粒（细菌、细胞、病毒）进入人或动物体内时，机体的免疫系统便产生相应的免疫球蛋白（immuneglobin），并以之结合，以消除异物的毒害。此反应称为免疫反应，此异物便是抗原，此球蛋白便是抗体。5.拷贝法：用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶。6.共价抗原免疫法这是在亲和标记抑制剂基础上发展起来的新的抗体酶制备方法。以亲和标记剂为半抗原，则抗体结合部位将产生与亲和基团电荷性质相反的基团，如亲核性，亲电性氨基酸，酸性氨基酸，碱性氨基酸等。五、抗体酶的筛选1.ELISA法；用ELISA法筛选对半抗原有亲和力的单克隆抗体。2.酶学活性检测法：直接用反应底物检测细胞培养液中抗体的酶活性。3.短过渡态类似物法：以过渡态类似物中含有的必需基团的基本结构单元做为筛选单克隆抗体的标准。4.基因筛选法：应用基因探针，对基因抗体库进行分析和筛选。六、抗体酶的应用前景在有机相合成用于阐明化学反应机制在医疗上的应用在医疗上的应用抗体酶在帮助戒毒方面的应用

Landry等用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰胆碱酯酶差不多，水解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能。因此，用人工抗体酶的被动免疫也许能阻断可卡因上瘾，达到戒毒目的。2.抗体酶用于肿瘤治疗

目前正在发展一种称为抗体介导前药治疗（ADEPT）技术，即将能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，这样酶就会通过和肿瘤结合的抗体而存在于细胞的表面。静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近，抗体酶就会将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物，从而提高肿瘤细胞局部药物浓度，增强对肿瘤的杀伤力，达到提高肿瘤化疗效果的目的。当然交药只能被抗体酶水解而不能被内源性酶水解，抗原还要尽量减少免疫原性。2.抗体酶用于肿瘤治疗

目前正在发展一种称为抗体介导前药治疗（ADEPT）技术，即将能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，这样酶就会通过和肿瘤结合的抗体而存在于细胞的表面。静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近，抗体酶就会将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物