生物分离工程07

生物分离工程液相色谱总体学习目的和要求

了解色谱原理，掌握各种常用色谱方法的操作与应用。

目录色谱原理与分类色谱过程理论模型分离度凝胶过滤色谱离子交换色谱疏水性相互作用色谱流通色谱色谱原理与分类－学习要点识记：色谱方法分类理解：色谱原理色谱原理与分类

－定义（chromatograph）定义p250

色谱是根据混合物中溶质在互不混溶的两相间分配行为的差别而引起移动速度的不同而进行分离的方法。色谱原理与分类

－原理（2）

色谱操作中互不混溶的两相分别称为固定相和流动相。固定相填充于柱内形成固定床，在柱的入口端加入料液后，连续输入流动相，料液中溶质在流动相与固定相之间扩散传质，产生分配平衡色谱原理与分类

－原理（2）在色谱过程中，分配系数大的溶质在固定相上存在的概率大，随流动相移动速度小。由此，溶质之间由于移动速度的不同而得到分离。色谱原理与分类

－流动相分类气相色谱液相色谱超临界色谱（p290）色谱原理与分类

－固相分类类型

分配色谱（固定相为液相）吸附色谱（固定相为固相）形状

纸色谱薄层色谱柱色谱纸层析薄层层析色谱原理与分类

－操作压力分类低压液相色谱（<0.5MPa）中压液相色谱（0.5-4.0MPa）高压液相色谱（>4.0MPa）色谱原理与分类

－流动相流动方式分类p252轴向流色谱径向流色谱色谱原理与分类

－分离操作方式分类p252洗脱色谱迎头色谱顶替展开（置换色谱p298）色谱原理与分类

－机理分类凝胶过滤色谱离子交换色谱反相色谱疏水性相互作用色谱亲和色谱色谱过程理论模型

－平衡模型p253模型假设整个层析柱中不存在传质阻力，分配平衡瞬间完成流动相的流动为平推流模型描述根据假设1：根据假设2：色谱过程理论模型

－平衡模型溶质在色谱柱中移动速度：洗脱时间洗脱体积模型特点：平衡模型形式简单，但信息量少，可用于解释一些基本色谱现象色谱过程理论模型

－平衡模型解释某些色谱现象p254拖尾现象优惠吸附中：洗脱时间短吐舌现象非优惠吸附中：洗脱时间短色谱过程理论模型

－理论板模型p255模型假设

溶质的分配平衡不能瞬间完成，需要一定的柱高模型示意色谱过程理论模型

－理论板模型的特性值p257平均洗脱时间散度底线处切线峰宽½高度处峰宽理论板色谱过程理论模型

－理论板模型特点仅用一个理论板数或HETP描述层析柱分离性能，使用方便；适用于低料液浓度的色谱过程无法确定影响分离性能的因素色谱过程理论模型

－轴向扩散模型及等板高度p259轴向扩散模型方程形式等板高度色谱过程理论模型

－VanDeemter方程轴向扩散系数Dz轴向分子扩散流速的不均匀现象与u无关与udp成正比通用方程：A－eddydiffusion涡流扩散

B－longitudinaldiffusion纵向扩散

C－masstransferresistance界面传质阻力

分离度

－学习要点识记：分离度的概念理解：如何分离度判断两个相邻洗脱峰的分离程度分离度

－定义及表述p260定义分离度又称分辨率，是表达两种洗脱曲线相邻的溶质相互分离的程度

分离度的表达Gauss洗脱曲线的分离度分离度的其它表征方法

－容量因子和选择性容量因子

容量因子是固定相与流动相间溶质分配量之比，用k’表示选择性

选择性为洗脱峰相邻的两种溶质的容量因子之比凝胶过滤色谱

－学习要点理解：凝胶过滤的原理和操作，凝胶过滤介质的要求和影响分离特性的因素应用：掌握凝胶色谱的应用及特点凝胶过滤色谱－定义凝胶过滤色谱利用凝胶粒子为固定相，是根据料液中溶质相对分子量的差别进行分离的液相色谱法凝胶过滤色谱－原理在GFC柱中，分子量大的溶质不能进入凝胶介质，而沿介质空隙流过分子量很小的溶质能够进入所有的细孔中，其洗脱体积接近柱体积分子两介于两者之间的溶质能够进入部分细孔中凝胶过滤色谱－原理(2)凝胶过滤色谱－分配系数凝胶过滤色谱的分配系数可用下式表示GFC的分配系数在0～1之间，分离精度有限。Smallestsolute:(acetone)Fullaccesstothepores,Vt;Largestsolute:(BlueDx2000)Excludedfromthepores,V0凝胶过滤色谱

－影响分配系数因素相对分子量

相对分子量一定的溶质的m值为常数，为凝胶介质对该溶质的有效孔隙率εp；

分配系数随相对分子量的增加而降低；分子形状凝胶结构凝胶过滤色谱－介质应满足条件p263亲水性高，表面惰性稳定性好，在较宽的pH和离子强度范围及化学试剂中保持稳定，使用寿命长；具有一定的孔径分布范围；机械强度高，允许较高的操作压力；凝胶过滤色谱－常用的GFC介质葡聚糖凝胶介质葡聚糖（右旋糖酐）与环氧氯丙烷合成琼脂糖凝胶介质琼脂糖与环氧氯丙烷合成其他亲水性高分子合成的凝胶介质多种多糖制备的凝胶介质SephadexGSepharoseCL/FFTSKSuperose凝胶过滤色谱－凝胶特性参数p265排阻极限不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量分级范围能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子量范围溶胀率介质溶胀后每千克干凝胶所吸收的水分的百分数其他参数凝胶粒径、床体积、空隙体积凝胶过滤色谱－影响操作的因素p266线速度料液体积料液浓度分子量与分配系数关系凝胶粒径凝胶过滤色谱－应用分离纯化脱盐相对分子量测定凝胶过滤色谱－特点p270溶质与介质不发生任何形式的相互作用，因此可采用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，产品收率接近100%；分离结束后无需苛刻的介质清洗或再生，循环操作易实现，提高了产品纯度；作为脱盐手段，GFC比透析法速度快、精度高；与超滤法相比，剪切应力小，蛋白活性收率高；分离机理简单，操作参数小，规模放大容易；凝胶过滤色谱－不足仅根据溶质间相对分子质量的差异进行分离，选择性低，料液处理量小，一般为柱体积的5%；经GFC洗脱展开后产品被稀释，因此需要在其它浓缩作用的单元操作后使用；凝胶层析的应用范围：

凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。凝胶层析的优点

凝胶层析具有设备简单、操作方便、分离迅速及不影响分子生物学活性等优点。目前已被广泛应用于各种生化产品的分离和纯化。例：凝胶柱层析分析蛋白质分子量大小

实验原理—凝胶层析

当某组分的Ka=0时(即Ve=Vo)，说明该组分完全不进入凝胶颗粒微孔，洗脱时最先流出若某组分的Ka=1(即Ve=Vo+Vi)时，说明该组分可自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，洗脱时，最后流出

Ka在0-1之间的组分，洗脱时Ka值小的先流出，Ka值大的后流出。在限定的条件下，Vi和Vo都是恒定值在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用。当洗脱液的体积等于Vo+Vi时，所有组分都应该被洗脱出来，即Ka的最大值为1。然而在某种情况下Ka值会大于1。这种反常现象说明这一层析过程不是单纯的凝胶层析，其中可能还夹杂有吸附或离子交换等过程洗脱体积与相对分子质量的关系1.大豆蛋白酶抑制剂；2.细丙二聚体；胰蛋白酶原；4.卵清蛋白；5.血清蛋白；6.血清蛋白二聚体；7.IgG；8.甲状腺球蛋白；9。蔗糖；10.糖原；11.细丙551；12.细丙；13.Rnase;14.α-乳清蛋白；15.肌红蛋白上方曲线为G-75；下方曲线为G-100蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关（Ve为洗脱体积）LogM=k1-k2Ve先测得几种标准蛋白质的Ve，并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量。LogMABCLogM测V测柱层析装置

(恒流泵层析柱收集器主机记录仪等5件套)

三.仪器和试剂

层析柱

（a）自制简易层祈柱（1．玻璃管；2.橡皮塞；3．尼龙网）；（b）普通商品柱；（c）双底板层析柱（1.洗脱液进出口；2.多孔底板；3．柱床；4．恒温水进口；5．恒温水出口；6．可调节的塞子）

层析系统连接示意图

1．密封橡皮塞；2．恒压管，3，恒压瓶；4，层析流出液，5．可调蜾旋夹；6.自动收集器；

7.核酸一蛋白质检测仪

BS－100自动部分收集器安装圈1．反全阀；2换管臂；3滴管；4，5换管臂固定螺丝；6.竖杆；7.竖杆囤定螓丝；8报警板；9.试管；10．收集盘；11.时间选挥旋钮；12.时间选择固定螺钉；13．自动开关；14、指示灯；15.电源开关；16．换向开关（逆、顺）；17．手动开关操作步骤1.装柱：凝胶溶胀后，湿法装柱，以柱床均匀、无气泡表面平整为佳

一般选用细长的拄作凝胶过滤。进行脱盐时，柱高50cm比较合适；分级分离时，100cm就足够了。一般是在柱内先装入约1/3高度的水或缓冲液，然后将溶胀好的凝胶在搅拌成稀浆的情况下慢慢倒入柱内，使其自然沉降。如此连续操作，可以得到一个均匀的柱床。柱装得不好往往造成洗脱区带加宽，甚至使一些本来可以分开的区带重叠。如装柱时的操作压力太大，会使凝胶床压得太实，从而降低流速。2.系统平衡：连接各装置，用缓冲液洗涤柱子，并打开检测器，使检测器稳定

新柱装好后，要用洗脱缓冲液平衡，一般用3--5倍体积的缓冲液在恒压下流过柱床。新装好的柱要检验其均匀性－可用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液过柱，观察色带是否均匀下降。也可以对光检查，看其是否均匀或有无气泡存在。3.上样：分别加标准分子量蛋白质和样品。

由于凝胶层析的稀释作用，似乎样品浓度应尽可能大才好，但样品浓度过大往往导致粘度增大，而使层析分辨率下降（下图）。一般要求样品粘度小于0.01Pa·s（帕斯卡秒），这样才不致于对分离造成明显影响。对蛋白质类样品浓度以不大于4％为宜。如果样品浑浊，应先过滤或离心除去颗粒后上柱。分析用量一般为每100mL床体积加样品1--2mL，制备用量一般为每100mL床体积加样品20--30mL，这样可使样品的洗脱体积小于样品各组分之间的分离体积，获得较满意的分离效果。加样时应尽量减少样品的稀释，及凝胶床面的搅动。这一点在分级分离时尤为重要。

样品黏度对洗脱曲线的影响（1）加葡萄糖2000，使终浓度为5%，相对粘度11.8;（2）加葡萄糖2000，使终浓度为2.5%，相对粘度4.2;（3）加葡萄糖2000，使终浓度为1%.

注意事项

要通过实验合理调整流速、检测器和记录仪的灵敏度，和记录仪的走纸速度，才能获得良好的洗脱曲线若峰有重叠，宜加长柱子，降低流速若峰间距离过大，峰过宽，宜缩短柱子，加快流速，降低走纸速度峰过高，可减少加样量，或降低检测器和记录仪的灵敏度峰过低则需加大灵敏度，或加大加样量。4.洗脱、记录

为了防止柱床体积的变化，造成流速降低及重复性下降。整个洗脱过程中始终保持一定的操作压，并不超限是很必要的。流速不宜过快且要稳定。冼脱液的成分也不应改变，以防凝胶颗粒的涨缩引起柱床体积变化或流速改变。在许多情况下可以用水作洗脱剂，但为了防止非特异吸附，避免一些蛋白质在纯水中难以溶解（析出沉淀），以及蛋白质稳定性等问题的发生，常采用缓冲盐溶液进行洗脱。离子浓度至少0.02mol/L方可获得较好的结果，因为凝胶含有少量羧基，会吸附少量阳离子而排斥少量阴离子。洗脱用盐等介质应比较容易除去才好，通常，氨水、醋酸、甲酸铵等易发挥的物质用得较多。对一些吸附较强的物质也可采用水和有机溶剂（如水-甲醇，水-丙酮等）的混合物进行洗脱。

洗脱剂的流速对分离效果也有很大影响，下图显示了同一凝胶柱在不同流速下的洗脱曲线。可见较快的流速下得到的冼脱峰也宽。流速低洗脱峰窄而高。也就是说，流速较低，分辨率较高，样品稀释较轻。

流速对洗脱曲线的影响

凝胶层析拄洗脱的三部分示意图各种层析柱装置的操作压（或静水压）（a），（b）操作压等于柱或贮液器内液面和出水接管末端的高度差；（c），（d）压力的大小是由恒压瓶内空气入口管的底部至出口接管末端的高度计算。向下（c）或向上（d）移动出水管无关紧要

欲达到流速恒定的目的，可自制恒压加液装置（下图），更可靠的是使用微量恒流泵。

凝胶层析恒压加液装置

5.结果计算及分析

凝胶的再生和保养

在洗脱过程中，所有组分一般都可被洗脱下来，所以装好柱后，可反复使用，无需特殊的再生处理。但多次使用后，凝胶颗粒可能逐渐沉积压紧，流速变慢。这时只需将凝胶自柱内倒出，重新填装。或使用反冲法，使凝胶松散冲起，然后自然沉降，形成新的柱床，这样流速会有所改善。

葡萄糖凝胶和琼脂糖凝胶都是碳水化合物，能被微生物（如细菌和霉菌）分解。聚丙烯酰胺凝胶本身不被微生物作用，但微生物还是能在此凝胶液中和凝胶床上生长，这样会破坏凝胶的特性，影响分离效果。为防止细菌生长和发酵，可用0.02％叠氮化钠、0.05%三氯叔丁醇（仅在弱酸有效，也适用于其他离子交换剂）或0.002％洗必泰、0.01％醋酸苯汞（在弱碱中有效，也适用于其他阴离子交换剂）以及0.1mol／L氢氧化钠溶液等作防腐剂。层析前再用水或平衡液将防腐剂洗去。

凝胶用过后，有几种保存方法：湿态保存：在水相中加防腐剂，或水洗到中性，高压灭菌封存（或低温存放）；半收缩保存：水洗后滤干，加70％乙醇使胶收缩，再浸泡于70％乙醇中保存；干燥保存：水洗后滤干，依次用50％、70％、90％、95％乙醇脱水，再用乙醚洗去乙醇，干燥(或60～80℃烘干）后保存。加乙醇时，切忌一上来就用浓乙醇处理，以防结块。凝胶过滤层析经常遇见的问题

1．流速慢（1）有气泡、出水管阻塞（2）没打开夹子（3）柱压太紧（操作压过大、长期使用、接头漏气）

2．拄内产生气泡

（1）上水口不流或皮管破裂，洗脱液外流

（2）接口漏气，如上水口螺丝拧的不紧

3．条带扭曲

（1）胶面不平

（2）样品或洗脱液中有颗粒

（3）装拄不均匀

4．分辩率不高

（1）装拄不均匀

（2）样品量过大

（3）流速太快

（4）拄不垂直或拄不合适

（7）胶不适当（5）长菌（6）拄下口软管太长离子交换色谱－学习要点理解：离子交换色谱的原理和操作，线性剃度洗脱过程和逐次洗脱过程应用：掌握离子交换色谱的应用特点离子交换色谱－概念离子交换色谱利用离子交换剂为固定相，是根据荷电溶质与离子交换剂之间的静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法阳离子交换层析过程离子交换树脂蛋白质高离子强度洗脱液洗高离子强度洗脱液洗加样平衡液洗收集离子交换色谱－分配系数溶质在离子交换剂上的分配系数可表示为其中m∞为离子强度无限大时溶质的分配系数分配系数对I很敏感，I微小的变化都会引起分配系数的改变；不同蛋白质B值相差很大离子交换色谱－主要阴离子交换配基二乙胺乙基，Diethylaminoethyl(DEAE)Quaternaryaminoethyl(QAE)季胺乙基，Quaternaryammonium(Q)离子交换色谱－主要阳离子交换配基羧甲基，Carboxymethyl(CM)磺丙基，Sulphopropyl(SP)Methylsulphonate(S)离子交换色谱－线性洗脱法线形洗脱法（lineargradientelution)流动相的离子强度线性增大，因此溶质的分配系数连续降低，移动速度逐渐增大特点难于洗脱的溶质在较小流动相体积下洗脱；改变流动相离子强度增大速度可调节溶质的洗脱体积；流动相离子强度（盐浓度）连续增大，不出现干扰峰，操作范围广；需要特殊调配浓度梯度的设备离子交换色谱－阶跃梯度洗脱法阶跃梯度洗脱法（Stepwiseelution）流动相的离子强度阶跃增大，溶质的分配系数的降低和移动速度的增大也是阶段式的。特点当阶跃速度很快，则其接近线性梯度洗脱；反之，则接近恒定洗脱；利用切换不同盐浓度的流动相进行洗脱，不需要特殊梯度设备，操作简便；流动相浓度不连续变化，易出干扰峰；易出现多组分洗脱峰重叠现象；离子交换色谱－洗脱时间线性梯度洗脱过程中溶质的迁移速度vp为m(I)不再为常数，而是I的函数由于与生物大分子相比，IEC柱内盐离子在固定相粒子内传质非常快，盐离子在两相间的平衡瞬间完成，则对盐离子而言，可有如下的方程：对线性梯度而言离子交换色谱－洗脱时间(2)p276通过测定不同流动相离子强度梯度下溶质洗脱位置离子强度Ip值，可获得Ip与GH之间的关系曲线其中洗脱时间为：（P275图7-21）离子交换色谱－

IEC柱内溶质迁移在线性梯度洗脱条件下，IEC柱内溶质区带的后部移动速度高于前部，即线性梯度洗脱具有区带浓缩作用；由于轴向返混和传质阻力的影响，溶质区带在洗脱过程中不断分散；洗脱操作前期，返混等占主导地位，区带宽度不断增加；随着区带宽度的增加，区带前后溶质运动速度差增大，即浓缩作用增大当区带宽度增至一定值后，浓缩与分散作用达到平衡，区带将以一定的宽度向下移动离子交换色谱－

分离度当离子强度梯度一定时，分离度与柱高无关当柱高一定时，分离度随离子强度梯度的降低而增大分离度与成反比离子交换色谱－特点料液处理量大，具有浓缩作用；应用范围广泛，通过优化条件可大幅度提高分离的选择性，所需柱长短；吸附作用机理明确，非特异性吸附小，产品回收率高；离子交换剂种类多，选择余地大，价格远低于亲和吸附剂；影响分离特性因素复杂；疏水性相互作用色谱

－学习要点理解：原理，影响疏水性吸附的因素

应用：掌握疏水性相互作用色谱方法对蛋白质分离

疏水性相互作用色谱

－定义疏水性相互作用色谱利用表面偶联弱疏水性基团（疏水性配基）的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱色谱法。疏水性相互作用色谱

－原理组成蛋白质的氨基酸中包括一些疏水性氨基酸基团，如苯丙氨酸，酪氨酸；这些基团大部分处于蛋白质内部，但有部分疏水基团暴露于蛋白质表面；在高离子强度盐溶液中，蛋白质表面的水化层被破坏，更多的疏水部分暴露在外这些暴露在外的疏水基团与介质上的弱疏水性配基发生疏水性作用，被固定相吸附蛋白质在疏水性吸附剂上的分配系数随流动相盐析盐浓度的提高而增大HIC采用高盐下吸附，低盐下洗脱疏水性相互作用色谱

－原理图示疏水性相互作用色谱

－疏水性吸附剂常用配基

苯基、短链烷基、烷氨基、聚乙二醇聚醚修饰密度

疏水配基修饰密度一般在10~40umol/ml疏水性吸附作用与配基的疏水性和配基目的成正比，故配基的修饰密度应根据配基的疏水性而异。影响疏水性吸附的因素p282

－离子强度、种类和破坏水化作用的物质离子强度及种类

蛋白质的疏水性吸附作用随离子强度提高而增大；离子的种类也对蛋白质疏水性吸附有着重要影响破坏水化作用的物质

离子半径大、电荷密度低的阴离子可减弱水分子间相互作用，具有破坏水化作用的性质（离液离子）

离液离子存在下疏水性作用减弱；乙二醇和丙三醇等含羟基的物质也具有影响水化的作用，降低蛋白疏水性吸附作用，作为洗脱促进剂；影响疏水性吸附的因素

－离液离子及顺序影响疏水性吸附的因素

－表面活性剂及温度表面活性剂

表面活性剂可与吸附剂及蛋白质的疏水部位结合，从而减弱蛋白质的疏水性吸附。温度

一般吸附为放热过程，而疏水性吸附的结合作用随温度升高而增大疏水性相互作用色谱

－特点p284在高盐浓度下疏水作用较大，HIC可直接分离盐析后蛋白质溶液可通过调节疏水性配基链长和密度调节HIC的吸附力吸附剂种类多，选择余地大反相色谱－学习要点p287理解：反相色谱技术的原理及操作，应用：了解反相色谱技术的应用范围及优缺点

反相色谱－定义定义

利用表面非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，是根据溶质极性（疏水性）的差别进行分离纯化的洗脱层析法与HIC的异同反相层析中溶质亦通过疏水性作用分配于固定相表面；反相层析固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现强烈的疏水性；必须采用极性有机溶剂或其水溶液进行洗脱反相色谱－分配系数溶质在反相色谱中分配系数取决于溶质的疏水性，疏水性越大，分配系数越大；当固定相一定时，可通过调节流动相的组成调整溶质的分配系数；流动相的极性越大，溶质的分配系数越大，因此反相层析多采用降低流动相极性的线性梯度洗脱法反相色谱－常用介质载体

硅胶、高分子聚合物微球配基

丁烷基(C4)、辛烷基(C8)、十八烷基(C18)或苯基修饰方法反相色谱－特点p289反相介质性能稳定，分离效率高；应用广泛，可用于分离蛋白质、肽、氨基酸、多糖、植物碱等，应用于科学研究、临床诊断、工业检测和环境保护等各个行业；作为产品纯化制备手段，多限于实验室规模的应用。流通色谱

－学习要点理解：流通色谱技术的原理及操作

应用：了解流通色谱技术的应用范围及优缺点流通色谱

－定义p291定义流通色谱指利用含有对流孔的介质为固定相的液相色谱法流通色谱作为一种分离模式，可包括各种吸附色谱，如IEC(ionexchangechromatography)、HIC(HydrophbicInteractionChromatography)、AC(adsorptionchromatography)和RPC(ReversedPhaseChromatography)流通色谱

－传统色谱的缺陷传统的吸附色谱介质孔径较小，一般在100nm以下，流体阻力大；通常的色谱操作压力下流体无法进入固定相介质的孔内，孔内传质为扩散传质；柱效随流速增大而迅速下降，动态吸附容量亦如此；流通色谱

－介质结构p292穿透孔

孔径在0.6~0.8um,孔内流动为对流形式；扩散孔孔径在50~100nm,孔内传质为扩散传质；流通色谱

－介质结构的特点p293流通色谱介质穿透孔之间以扩散孔相连，保证了介质大的比表面积和溶质吸附量扩散孔长度大大缩短，降低了扩散传质阻力；色谱操作线速度大于500cm/h流通色谱

－柱效色谱柱效的普遍化公式为在u很大时，其中因此流通色谱

－介质制备p294POROS流通色谱介质该制备方法是首先合成微球，然后通过聚集形成聚集体，最终经聚集体的再聚合形成所需粒径的分离介质联合致孔法

通过固、液联合致孔方法合成双分散孔型层析介质，该方法适用范围广，合成方法简单；连续床