尹礼国第4章核酸化学2015年10月12日

第四章核酸化学NucleicAcid目录前言第一节核酸的组成第二节RNA的结构和生物功能第三节DNA的结构和生物功能第四节核酸及核苷酸的性质第五节核酸及其组分的分离纯化第六节核酸的分析测定及研究方法前言核酸的发现1869年，F.Miescher从遗弃的绷带的脓细胞中分离出含磷量高的核素（nuclein）。R

.Altmann从酵母和动物中分离出与核素同样的物质，1889年定名为核酸。核酸研究的大事件1868年FridrichMiescher从脓细胞中提取“核素”19世纪末到20世纪初，核酸研究被重视，20世纪后半叶核酸研究进一步被重视1902，E.Fischer研究糖和嘌呤而获诺贝尔化学奖。

Kossel发现构成核酸的4种碱基，1910诺贝尔化学奖Levene等对核糖、脱氧核糖、核苷、核苷酸进行了大量研究1928年FredGriffith发现了细菌的（致病)转化现象1944年Avery等人证实这种转化现象中DNA发挥了关键作用，提出DNA是遗传物质1952年的噬菌体试验进一步证实核酸在遗传中的作用1953年Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构，1958年Crick提出遗传信息传递的中心法则，1961年Jacob和Monod提出操纵子学说，1965年Nirenberg发现遗传密码1970年Temin和Baltimore发现逆转录酶1981年Gilbert和Sanger建立DNA测序方法，1985年Mullis发明PCR技术，1990年美国启动人类基因组计划(HGP)

，1994年中国人类基因组计划启动，2001年美、英等国完成人类基因组计划基本框架

核酸与遗传变异生物体的遗传变异是由核酸决定的，核酸不仅与生命的正常活动有着密切关系，而且与生命的异常活动息息相关。第一节核酸的组成成分核酸的组成核酸核苷酸磷酸核苷戊糖碱基水解核酸（DNA和RNA）是线性多聚核苷酸，基本结构单元是核苷酸DNA与RNA结构上有相似之处，也有区别，组成成份上略有不同核酸代表戊糖，对DNA而言为脱氧核糖，对RNA而言为核糖；

代表碱基

代表磷酸基核苷酸核酸是由核苷酸经磷酸二酯键连接而成一、糖组分DNA含β-D-2-脱氧核糖RNA含β-D-核糖二、碱基嘌呤碱：腺嘌呤、鸟嘌呤嘧啶碱：胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶稀有碱基：三、核苷nucleoside糖与含氮碱基缩合成糖苷，C-N键C1——N1（嘧啶）C1——N9（嘌呤）碱基与糖环平面垂直，碱基有顺式、反式。H2OH2O碱基磷酸戊糖核苷键酯键四、核苷酸DNA、RNA均由3’-5’磷酸二酯键连接常见的八种核苷酸M/单，D/二，T/三；P-磷酸RNA的名称为单/二/三苷酸，

DNA在单/二/三前加脱氧两字。

如AMP称腺苷一磷酸(或腺苷酸）

dAMP称为脱氧腺苷一磷酸（脱氧腺苷酸）稀有核苷酸与上类似核苷酸的衍生物生物体内分布最广和最重要的一种核苷酸衍生物。（1）ATP(腺嘌呤核糖核苷三磷酸)是重要的能量转换中间体ATP含两个高能磷酸键：水解时可释放大量自由能，推动体内各种需能反应。ATP也是磷酰化剂：磷酰化的底物具较高能量（活化分子），是许多生物化学反应的激活步骤。

(2)GTP(鸟嘌呤核糖核苷三磷酸)生物体内以游离形式存在，也是一种高能化合物具有类似ATP的结构主要是作为蛋白质合成中磷酰基供体在许多情况下,ATP和GTP可以相互转换（3）cAMP和cGMPcAMP3’,5’环腺嘌呤核苷一磷酸cGMP3’,5’-环鸟嘌呤核苷一磷酸——细胞间信使cAMP和cGMP的环状磷酯键是一个高能键：pH7.4时水解能约为43.9kJ/mol，比ATP水解能高得多。五、修饰成分核酸中存在的一些一定部位被化学基团取代的组分由修饰碱基组成的核苷戊糖的2位羟基氢原子被甲基取代的核糖组成的核苷碱基与戊糖连接方式不同形成的核苷（如假尿嘧啶核苷）修饰成分主要存在于RNA中，DNA中较少。第二节RNA的结构一、RNA的种类、分布、功能除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA(smallnon-messengerRNAs,snmRNAs)。

核糖体RNA核内不均一RNA核内小RNA细胞核和胞液线粒体功能rRNAmRNAmtrRNAtRNAmtmRNAmttRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL-RNA核糖体组分蛋白质合成模板转运氨基酸成熟mRNA的前体参与hnRNA的剪接、转运rRNA的加工、修饰蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组分RNA信使RNA转运RNARNA核内小胞浆小RNA细胞核和胞液线粒体功能rRNAmRNAmtrRNAtRNAmtmRNAmttRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL-RNA蛋白质合成模板转运氨基酸的前体的加工、修饰蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组分核仁小RNA含量80％5％10-15％二、RNA一级结构概念组成RNA分子的核苷酸通过3’,5’-磷酸二酯键连接而成的多核苷酸中核苷酸的排列顺序通常简化表示，用从5’端向3’端的碱基顺序表示三、核酸的降解碱水解(DNA在弱碱性条件下不易水解)酸降解（产物因条件不同）酶法降解（不同的酶有不同的酶切特性）核糖核酸酶与脱氧核糖核酸酶核酸内切酶、核酸外切酶四、RNA一级结构的特点研究最多：tRNA、rRNA及一些小分子RNA。1、tRNA分子特点：5’-末端总是磷酸化，常为pG3’-末端都具有－CCA－OH的结构，A始终未磷酸化分子中含有较多的修饰成分（10-20%）约由75－90个核苷酸组成五、RNA的高级结构多数RNA分子是单链由磷酸二酯键连接而成，可自身回折，形成发夹结构不能形成碱基配对的形成突环（一）tRNA的二级结构:三叶草形氨基酸接受区反密码区二氢尿嘧啶区TφC区可变区（二）tRNA的三级结构在二级结构基础上，突环上未配对的碱基由于整个分子的扭曲形成配对，形成三维空间的立体结构所有tRNA的三维构象相似，有利于携带氨基酸的tRNA进入核糖体的特定部位例：酵母苯丙氨酸tRNA的三级结构为倒L形第三节DNA的结构一、DNA的一级结构DNA是由脱氧核苷酸经3’,5’-磷酸二酯链连接一级结构即脱氧核苷酸的排列顺序基因与基因组生物性状基本上都由DNA分子决定DNA的不同片段有着不同的功能，不同的生物性状对应相应的DNA片段基因就是一段相对独立的DNA片段一个细胞的DNA含有许多基因，功能不同，一个DNA分子上的全套基因称为基因组一个基因组中各个基因的排列顺序称为DNA顺序组织基因组学基因组学[1]

（英文genomics），研究生物基因组和如何利用基因的一门学问。用于概括涉及基因作图、测序和整个基因组功能分析的遗传学分支。该学科提供基因组信息以及相关数据系统利用，试图解决生物，医学，和工业领域的重大问题。基因组研究应该包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学（structuralgenomics）以基因功能鉴定为目标的功能基因组学（functionalgenomics)，又被称为后基因组（postgenome）研究，成为系统生物学的重要方法。真核细胞染色质DNA的一级结构特点真核细胞染色质DNA具有许多重复排列的核苷酸序列在真核细胞中，除组蛋白外，其它所有蛋白质都由DNA中单一序列决定的，这种序列的大小不等，每一段顺序决定一个蛋白质结构，为一个蛋白基因，称为结构基因在DNA分子中，除了编码蛋白质和RNA的一些段落外，还有一些段落不编码任何蛋白质和RNA，可以存在于基因与基因之间，也可出现在基因内，前者称为间隔顺序，后者为插入顺序。通常将插入的顺序称为内含子，把编码部分称为外显子。回文结构二、DNA的二级结构（一）Chargaff定则：DNA碱基组成具有生物种的特异性；无组织/器官特异性；不受生长发育、营养状况及环境条件的影响。（二）DNA二级结构的多态性Watson-Crick双螺旋结构模型左旋DNA-Rich模型三链DNA四链DNADNA双螺旋结构的研究背景和历史意义碱基组成分析Chargaff规则：[A]=

[T][G]

[C]碱基的理化数据分析A-T、G-C以氢键配对较合理

DNA纤维的X-线衍射图谱分析★3.2.1DNA双螺旋结构的研究背景和历史意义碱基组成分析Chargaff规则：[A]=

[T][G]

[C]碱基的理化数据分析A-T、G-C以氢键配对较合理

DNA纤维的X-线衍射图谱分析DNA双螺旋结构发现的历史意义：揭示了生物体遗传信息储存及表达的分子机制开创了现代分子生物学生物学发展史上的里程碑3.2.2DNA双螺旋结构模型要点（Watson,Crick,1953）DNA分子由两条相互平行但走向相反的脱氧多核苷酸链组成，以右手螺旋方式绕同一公共轴盘。形成大沟(majorgroove)及小沟(minorgroove)相间。嘌呤碱和嘧啶碱基位于螺旋的内侧;磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧，彼此以3’,5’-磷酸二酯键连接，形成DNA分子的骨架。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成90°角。3.2.2DNA双螺旋结构模型要点（Watson,Crick,1953）DNA双螺旋结构模型要点

（Watson,Crick,1953）螺旋直径为2nm，相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10对碱基。碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成氢键配对（互补配对形式：A=T;GC）。碱基互补配对

TAGCDNA双螺旋结构模型要点

（Watson,Crick,1953）氢键维持双链横向稳定性碱基堆积力维持双链纵向稳定性。离子键屏蔽磷酸基团之间的静电斥力DNA双螺旋结构的多样性天然DNA在不同的湿度、不同盐溶液中的DNA构象不同DNA双螺旋通过扭曲和折叠所形成的特定构象。

包括：不同二级结构单元间的相互作用单链与二级结构单元间的相互作用

DNA的拓扑特征超螺旋是DNA三级结构的主要形式。（三）DNA的三级结构三、DNA的三级结构DNA双超螺旋结构真核细胞染色质的组装原核生物和真核生物基因组比较原核生物基因组特点重复序列少，多为编码区多为操纵子形式组织有重叠基因存在真核生物基因组特点重复序列多，大量序列不编码蛋白质（即间隔序列）不连续基因由内含子与外显子交替排列组成以染色体存在第四节核酸及核苷酸的性质一、溶解性DNA白色纤维状固体，RNA白色粉末状固体，都微溶于水，不溶于一般有机试剂（乙醇沉淀核酸），钠盐易溶于水。DNA、RNA在生物细胞内大都与蛋白质结合成核蛋白DNA蛋白的溶解度在低浓度盐溶液中随盐浓度的增加而增加，在1mol/LNaCl溶液中溶解度比纯水高2倍，可是在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，仅为水的1%，几乎不溶解。RNA蛋白在盐溶液中的溶解度受盐浓度影响较小，在0.14mol/L的NaCl溶液中的溶解度较大。DNA蛋白、RNA蛋白在不同pH中的溶解度不同二、核酸及其组分的两性性质核酸和核苷酸具有磷酸基，因而呈酸性，同时有含氮碱基，具有碱性，为两性电解质核酸分子的多核苷酸链除了末端磷酸残基外，磷酸二酯键中的磷酸残基只有一个解离常数（1.5），当溶液的pH高于4时，核酸分子的磷酸基全部解离呈多阴离子状态RNA的等电点约为2.0~2.5，而DNA的等电点为4~4.5三、紫外吸收碱基具共轭双键强烈吸收240-290nm波段紫外光，最大吸收峰在260nm附近。三、紫外吸收1、DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2、确定所提取的核酸是否纯品。

1）DNA：≈1.8纯品

OD260/OD280

＞1.8RNA污染＜1.8protein污染

2）RNA：

OD260/OD280≈2.0纯品3、紫外可使相邻TT间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，引起基因突变。A=TC=GT=AT=A紫外A=TC=GTATA四、核酸的变性与复性变性是指在某些理化因素作用下，核酸的双螺旋结构破坏，氢键断裂，变成单链，并不涉及共价键的断裂。核酸变性是核酸复制、转录的前提方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。变性后其它理化性质变化：OD260增高

黏度下降比旋度下降 浮力密度升高酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失核酸的变性热变性：升温使DNA双链拆开，一般在90℃以上完全变性酸碱变性:pH低于3或高于10时，DNA双链打开化学试剂变性：用尿素、甲酰胺、甲醛等试剂破坏氢键等次级键，使DNA变性融熔温度（融点）DNA随温度升高而变性的过程是一个跃变过程，类似于固体的融化。将引起DNA变性的温度称为融熔温度或融点，融熔温度处的增色效应达50%（即DNA变性一半）（G+C）%=（Tm-69.3）×2.44复性加热后的DNA溶液若冷却至适当温度，变性的DNA可以恢复其原有的理化性质。此过程中，被拆开的两股多核苷酸链重新由氢键连接形成双螺旋结构，是一个可逆的过程。第五节核酸及组分的分离纯化一、分离核酸的一般原则防止核酸酶的降解防止化学因素的降解防止物理因素的降解二、DNA的分离纯化DNP与RNP的分离在生物体内，DNA和RNA通常与蛋白质结合成核蛋白复合物，利用0.14mol/L盐溶液中RNP溶解，而DNP溶解最小的性质将二者分开。将细胞提取物用1mol/LNaCl溶解，然后稀释至0.14mol/L，使DNP沉淀，离心得到的沉淀为DNA蛋白DNP中蛋白质的分离用含辛醇（或异戊醇）的氯仿振荡核蛋白溶液，蛋白质发生变性，而处于水相和氯仿相之间，DNA处于水相，再用酒精将DNA沉淀SDS法苯酚法纯化三、RNA的分离纯化酚提取法：用缓冲液饱和的酚溶液直接处理组织或细胞除去蛋白质和DNA稀碱或盐溶液，结合调节等电点沉定法制备RNA提取不同种类的RNA时，先离心将细胞器分离后，再从细胞器中提取某种