流式细胞术课件

流式细胞仪介绍

Tohelpallpeoplelivehealthylives流式细胞术－历史回顾1973年BD推出世界第一台流式细胞仪 FACSI（FluorescenceActivatedCellSorter）1980年中国的第一台流式细胞仪FACSII生物学、免疫学、遗传学、药理学、肿瘤学、血液学、临床检验等领域FACS流式细胞仪市场占有率：全球75%，中国70%，FACSAria

市场占有率达到90％。流式细胞术定义：在流动的状态中检测单个细胞或颗粒的多项理化及功能性指标的一种分析技术特点：特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析检测的样本种类多样：前提－单细胞悬液外周血，骨髓，细胞穿刺液，洗脱液，腹水，实体组织（肿瘤、腺体、淋巴结），培养细胞流式分选：以流动状态的单个细胞的各项特性进行细胞分离流式检测原理通过激光激发高速流动的单个细胞所携带的各种荧光素和荧光染料，并检测由此产生的散射光和荧光的发射光，通过各种光信号的强弱来反应细胞的各种特征。流式细胞仪的分类台式机型临床型：FACSCalibur，FACSCanto，FACSCount科研型:LSRⅡ，FACSAria，FACSArray非台式机型:FACSVantageSE，FACSDiVa流式细胞仪的结构组成液流系统：将待测样本按一定的速度一个个通过检测区光学系统：产生并收集散射光和荧光信号电子系统：光学信号处理和显示液流系统－样本流细胞或微粒的悬浮液通过50－300um的小孔引入鞘液，使得细胞或微粒单个单个流经检测区FALSSensor90LSSensorLaser样本细胞的大小

0.5-40微米液流系统－鞘液当液流系统符合雷诺兹公式时，样品流能保持在液流的中心区流动而不和鞘液混合，即形成层流雷诺兹公式（Reynoldsnumber）当Re<2300,液流可以一直保持层流当

Re>2300,将会发生湍流流体动力学的聚焦效应（HydrodynamicFocusing）：大量的鞘液流包裹少量的样本流，并对样本流在中轴位置具有聚焦的作用液流系统－压力系统液流系统－压力系统光学系统－光源光束需和细胞或微粒在检测区正交特定的荧光染料需要特定波长的激发光源两类激发光源：激光器：易聚焦成高能量的分布的光斑，弧光灯：光束散交，能量低，位置和功率闪烁，光学系统－散射光信号前向角散射光（FSC):和细胞或待测颗粒的大小和表面积有关可以用来区分死/活细胞侧向角散射光（SSC):和细胞结构复杂性和颗粒性有关可以用来区分粒/非粒细胞光学系统－散射光信号散射光可以用来区分不同细胞群体的最基本的形态差异

- 常常用散点图“DotPlots”来显示

- 图上的每一个点代表一个细胞的相应信息DotPlot(lysedwholeblood)光学系统--荧光信号细胞标记上荧光物质后，这种荧光物质要求特定波长的激发光来激发荧光强度是和细胞上标记上的荧光染料的量正相关荧光在90°角的方向上检测荧光物质被激发以后产生的发射光将由特定的荧光通道来接收特定检测是通过光学滤片和透镜来控制的荧光补偿的调节FL1=FITC+x%PEFL2=PE+y%FITC荧光补偿的调节FL2-%FL1FL-1(FITC)FL-2(PE)FL1-%FL2(0–30%)(0–1%)如何进行补偿？1、选择补偿管用的细胞，一定要含有补偿用的抗体阳性和阴性的细胞群，阳性群体的荧光并尽可能强。2、染色同型对照，调节电压尽可能高，一定要能看到完整的阴性细胞群，大一点的没有太大关系。3、选择细胞群中自发荧光相同的细胞群进行分析（例如外周血可选择淋巴细胞）。光学系统－光学滤片长通滤光片只容许某一波长之上的光通过短通滤光片容许某一波长之下的光通过带通滤光片容许某一波长的上下一个极小范围内的光通，带宽可以特定化二向色性当滤光片和光源成45度角的方向放置，原本被通过的光照样通过，而原本会被封锁的光将会沿着90度角的方向被反射出去LONG(700nm)550LongPass650ShortPassSHORT(500nm)PassThroughFilters600/100BandPassTransmitted<650nm>550nm550-650nm(600±50)WavelengthsBlocked>650nm<550nm<550nm&>650nmShortPassLongPassBandPassLONG(700nm)550LongPass650ShortPassSHORT(500nm)Dichroic

FiltersTransmitted<650nm>550nmDiflected90°>650nm<550nm单激光光学平台光电二极管检测区高感度PMTs氩离子激光器光学系统－荧光监测器两种常见的荧光监测器光电二级管:用于强信号的探测(如,前向散射光探测器)光电倍增管(PMT):比光电二极管更敏感但太强的光会对其造成破坏有最适的波长检测范围电子系统－数据的采集和处理对探测器检测到的信号加以处理前置放大在从远处的探测器传到中央电子系统前对信号进行放大放大调节信号的强度线性的或对数的放大计算脉冲信号的积分，高度或宽度时间调整多参数检测时所必须的数模转换流式细胞仪的分选功能对细胞或其他微粒的悬液中我们所感兴趣的部分用具有分选功能的流式细胞仪将之分选出来两种分选方式机械式：FACSCalibur带电式：FACSAria流式细胞仪的分选功能对细胞或其他微粒的悬液中我们所感兴趣的部分用具有分选功能的流式细胞仪将之分选出来两种分选方式机械式：FACSCalibur检测点后装有一机械装置捕获所需要的细胞一旦检测到所需要的细胞捕获装置就会移动到核心样本流处细胞被捕获转移到收集容器中然后捕获装置又离开核心样本流回复到原始位置带电式：FACSAria回顾液流系统光学系统电子系统细胞周期及倍体分析倍体分析原理细胞增殖周期：分为G0、G1、S、G2、M期。G0/G1期细胞为二倍体细胞，其DNA含量用2N表示，G2/M期为四倍体细胞，其DNA含量用4N表示，S期细胞DNA含量介于此两者之间。利用荧光染料如PI（Propidiumiodide）与细胞内的DNA结合，结合量多少可反映细胞内DNA含量。FCM分析一个群体细胞峰DNA倍体与细胞周期时，将DNA含量直方图分为三部分，即G0/G1,S,G2/M期三个细胞峰。G0/G1和G2/M细胞峰DNA的含量成正态分布，S期细胞峰则是一个加宽的正态分布。细胞周期示意图及DNA含量直方图细胞周期示意图及DNA含量直方图荧光信号的面积一般对DNA倍体测量时采用面积（如FL2-A），这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映DNA的含量，当形状差异较大，而DNA含量相等的二个细胞，得到的荧光脉冲高度是不等的，经过对荧光信号积分后，所得到的信号值就相等。宽度FL2-WFL2-W常用来区分双联体细胞，由于DNA样本极容易聚集，当两个G1期细胞粘连在一起时，其测量到的DNA荧光信号（FL2-A）与G2期细胞相等，这样得到的测量数据G2期细胞比例会增高，影响测量准确性几个概念DNA指数(DI)：通过比较G0/G1期细胞峰位置的变化显示，为

测量样本G0/G1期DNA荧光通道数与正常人淋巴细胞G0/G1期DNA荧光通道数比值。CV值：变异系数，由于仪器及实验样本的影响，测定过程中存在的漂移现象，其包括两部分，即反应仪器精密度的CV值及实验样本的CV值。细胞凋亡的流式检测凋亡与坏死凋亡---细胞主动参与自身死亡的过程。凋亡程序有一些特殊形态学特征，包括质膜的改变，如细胞膜不对称性和细胞附着消失，胞浆和细胞核固缩，核内DNA裂解。到了晚期，凋亡细胞断裂成“凋亡小体”，并很快被巨噬细胞清除，而不会引起周围细胞的炎症损伤坏死---通常是由细胞损伤或细胞毒物作用引起，在形态学和细胞生物特性上，与凋亡有着本质的区别。坏死细胞的早期变化是细胞和线粒体肿胀，继而细胞膜破坏。不同于凋亡的是，坏死的细胞胞质内容物（多为蛋白水解酶）释放，会引起周围组织的炎症反应细胞凋亡检测方法

细胞凋亡检测的常用手段主要分为形态学检查、分子生物学方法、免疫电泳法和细胞学检查。其中，用流式细胞术研究细胞凋亡在技术和应用领域方面应用日益广泛。由于可以对凋亡的多种特征进行快速、灵敏、特异的定性分析和定量分析，流式细胞术已经成为凋亡分析的重要检测手段。流式细胞术检测细胞凋亡细胞形态的变化细胞质膜内侧的磷脂酰丝氨酸外翻导致的细胞膜不对称性消失线粒体膜电位的改变蛋白水解酶——Caspase酶的活化核酸内切酶活化导致的DNA断裂凋亡峰的检测细胞散射光变化在细胞凋亡的初始阶段，细胞膜发生皱缩，导致FSC减小，而SSC增加或者维持不变凋亡峰检测：在凋亡细胞中，利用流式检测PI染色后的DNA，可以发现一个亚群，称为A0细胞，该细胞DNA染色减少。研究者认为DNA染色减少的原因是因为细胞内DNA的程序性减少，源于DNA片断化，而导致小分子量的DNA漏出照成的。凋亡峰检测PI-Fluorescence#EventsApoptoticcellsNormalG0/G1cellsProtocols用70%的乙醇固定细胞1ml细胞悬液(1-5X106)均匀,快速混合于10ml预冷的70%乙醇中,置于4℃冰箱中≥2小时从细胞中萃取出小分子量DNA离心收集细胞,彻底去除乙醇,加入50ulDNA萃取缓冲液置于37℃水浴30分钟离心细胞加入1mlPI/RNAse染液,室温避光孵育30分钟流式检测磷脂酰丝氨酸的翻转细胞发生凋亡时会有一系列的形态学特征性改变，其中，质膜的改变是早期凋亡的特征之一。细胞发生凋亡时，胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）从胞膜内侧翻转到外侧，暴露于细胞外表面。AnnexinV是一个35-36kD的Ca2+依赖性的磷脂结合蛋白，它与磷脂酰丝