分子遗传学第四章 基因操作

第四章基因操作

Genemanipulation

第一节碱基互补的能力

一、DNA的热变性1．G－C含量高的DNA具有较高的熔解温度，可以根据熔解温度的不同将GC含量不同的DNA分子分开，并可推测DNA分子中G－C的相对含量。2．根据熔解温度的差别在DNA分子中作基因定位和分离基因。组蛋白是与核DNA结合的碱性蛋白，富含精氨酸，其编码区相对富含G－C对。海胆组蛋白基因在较底温度时（61℃）的变性电镜图，每种组蛋白基因被一个富含A－T对区域间隔开。用S1核酸酶处理，消除单链。H1H2AH3H2BH4二、互补单链的复性

利用互补单链复性的特点可以确定基因缺失的位置和大小：一个缺失突变体的DNA和一个野生型的DNA一起复性后就可确定缺失区。

ab

cdea,

b,c,d,e,abdea,b,d,e,

abcde

a,b,c,d,e,abde

a,b,d,

e,a

bcd

ea,b,d,e,HeatMixandcool三、染色体上DNA序列的定位

用特异性RNA或DNA作探针与染色体上相应的DNA互补区域作杂交，从而确定该特异性基因的位置称染色体原位杂交（insituhybridizationofchromosome）。Insituhybridizationofhumanmetaphasechromosomesusingfluorescenttechnique(FISH)第二节限制性内切酶

一、宿主限制现象XXABX-AX-BABAB

X-AX-BX-AX-B100%100%0.002%100%PhageInfectBacteria从两个不同菌株A和B来的噬菌体X具有不同的感染能力X-AAX-ABX-BAX-A100%100%很差无法分离到能感染A细菌的X-B来的噬菌体用很少一些感染力差的结果说明：噬菌体的宿主范围取决于它所来源的细菌菌株，而不是噬菌体的基因型；宿主的基因型对噬菌体有一种修饰作用，但并不改变噬菌体DNA的序列。细菌的基因型决定该细菌对各种噬菌体感染的敏感性，一种噬菌体的基因型决定它所能感染细菌的范围，它们之间具有密切的依赖和限止关系。

在不同基因型的细菌中生长的噬菌体其具有不同的感染能力二、DNA的修饰☆是什么限制了X－B噬菌体在菌株A中的繁殖呢？

是由于宿主的一种核酸酶的作用，它能将噬菌体DNA切成许多无感染力的片段，宿主细胞具有破坏其陌生DNA的防卫系统。☆怎样保护宿主自身的DNA和感染性X－A噬菌体DNA免受宿主核酸酶的攻击？

有一种酶能在特定序列上修饰特异性碱基，但是并不改变这些碱基的编码性质。如在胞嘧啶和腺嘌呤上增加一个甲基后就能保护DNA免受核酸酶的攻击，该过程称甲基化作用（methylation）。在宿主限制现象中有两个相互的过程：（1）由于宿主核酸酶的作用破坏了侵入的噬菌体DNA，从而限制了噬菌体的繁殖；（2）噬菌体DNA修饰免除了限制酶的作用。BacteriumAhasthecapacitytomodifyDNAwhereasBdoesnot

三、限制酶的特异性1970年，HamiltonSmith从流感嗜血杆菌d株分离到能识别特定核苷酸序列，切点专一的限制酶－HindII

↓

5’－G－T－Py－Pu－A－C－3’3’－C－A－Pu－Py－T－G－5’↑Smith进一步证明宿主诱导的甲基化作用保护了具有同样序列的DNA免受HindII的切割：↓m

5’－G－T－Py－Pu－A－C－3’3’－C－A－Pu－Py－T－G－5’

m↑

**Py：pyrimidinePu：purineE.coli的R质粒的一个基因产生的限制酶EcoRI，它对SV40病毒的环状DNA分子上只有一个切点。

5’－G－A－A－T－T－C－3’3’－C－T－T－A－A－G－5’

上述序列是旋转对称的。由于切点是错开的，因此使SV40的环状分子切开成具有粘性末端（stickyends）的线状分子。上述序列中腺嘌呤的甲基化也能保护DNA免受EcoRI的切割。

mm

回文序列—palindrome↓

5’……G

A

ATTC……3’

3’……CTT

AAG……5’↑EcoRI切点的两条链中的序列从相反方向阅读是一样的，称为回文序列—palindrome。从正向和反向阅读是同一句子：

ABLEWASIEREISAWELBA几种限制酶的名称和识别序列T↓CTAGA

AGATC↑TXbaI

C

TGCA↓G

G↑ACGTCPstI

A↓AGCTT

TTCGA↑AHindIIIGAT↓ATC

CTA↑TAGEcoRV

G↓AATTC

CTTAA↑GEcoRI

G↓GATCC

CCTAG↑GBamHI识别位点序列内切酶四、限制酶作图1．在DNA分子上确定限制酶切点的相对顺序是一种重要的染色体作图法。从图上任何两个切点之间的距离可估计出核苷酸的数目。2．方法要点：特定来源的DNA经不同的酶消化后，样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，可得到限制位点的图谱。123455,3,3,5,酶1酶21234532P32P酶1酶2Digestion1234532P1234532P32PABCDEF(a)(b)32P1234512345酶2ABC12345DEF1245酶1(a)(b)根据重叠的亚片段排列原先片段的顺序亚片段位于原先片段12345ADAEBEBFCF(c)3根据重叠的亚片段排列原先片段的顺序，可以得到一个DNA的酶切图谱。1122334455DAEBFC123452121酶切位点2121酶切图谱练习题：

从某一生物的基因组BamHI文库中获得了长3.0kb的片断,如用EcoRI消化该片断获得1.7kb、0.9kb和0.4kb三种片断;如用HindⅢ消化获得1.6kb和1.4kb片断;如用上述两酶混合消化获得1.2kb、0.9kb、0.5kb合0.4kb四种片断。根据上述结果绘制限制性图谱。要求标出EcoRI、HindⅢ和BamHI的位点和它们间的距离。第三节重组DNA

在细菌细胞中选择性地扩增特定DNA片段的过程称分子克隆（molecularcloning）。重组DNA技术的基本步骤

（1）获得目的基因，一般是有重要生物学功能的外源基因。（2）在限制性内切酶和连接酶的作用下，将目的基因与克隆载体相连接，组成一个新的重组DNA分子（recombinantDNA（3）将重组DNA分子引入受体细胞，并在细胞中进行DNA复制，最常用的受体细胞为大肠杆菌。（4）对转化子（含有重组分子的受体细胞）进行筛选和鉴定，以确认含有外源基因。大量培养细胞可获得目的基因的大量拷贝，或基因表达的产物等。一般意义上的重组DNA技术专指在细菌细胞中特异性地扩增特定DNA片段的分子克隆技术，广义上的重组DNA技术还延伸到整个基因工程的应用领域。重组DNA技术的基本步骤

外源DNA载体重组E.coli目的基因的制备构建重组DNA分子，首先要获得有用的目的基因片段，最常用的方法有三种：（1）直接从一生物中提取基因组DNA，并构建该基因组的文库（genelibrary）再从中调出目的基因的克隆。（2）以mRNA为模板反转录合成互补的DNA，称cDNA，并构建cDNA克隆。（3）采用聚合酶链反应（PCR）特异性地扩增某一目的基因的片段。细胞内总DNA的提取和基因文库的构建各种生物的特定组织（如血液、肝脏、植物组织、细菌细胞等）都含有大分子量的DNA。由于目的基因位于整个基因组DNA中，难以检出和分离，可以先将基因组DNA用内切酶切成较小的片段，再将它们分别与载体相连，并转入细菌细胞中进行繁殖和扩增，再对各个不同的克隆作出检定。非选择性地在细菌细胞中克隆某一生物的随机DNA片段的过程称鸟枪法，全部克隆集合体称某一生物的基因文库。组成一个生物的基因文库的全部重组质粒或重组噬菌体中的目的基因就代表了一个生物的整个基因组。一、直接产生粘性末端用于组成一个新的重组DNA分子（recombinantDNA）16-2

二、加尾连接（Tailing）1．同聚物加尾末端转移酶（terminaltransferase）能催化DNA的3’末端加上核苷酸尾，如将dA和dT加到不同的DNA末端，就可以连接成重组质粒，polyG和polyC也可用相同方法加尾。

同聚物加尾连接的优点：加尾后DNA片段自身不会环化，可提高异源DNA重组率。缺点：加入的polyA和polyT可能影响基因表达；外源基因克隆扩增后不能用限制酶重新从重组质粒中切出来。TTAAAATT5,3,3,5,5,3,3,5,AAAAAAA5,3,5,3,AAAAAAATTTTTTTTTAAAAAAAAATTTTTTTTT5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,5,3,EcoRI外切酶末端转移酶dATPshear外切酶末端转移酶dTTPTTTTTTTTTPlasmidDNADrosophilaDNADNApolymerase,DNAligase末端转移酶（terminaltransferase）能催化DNA的3’末端加上核苷酸尾，如将dA和dT加到不同的DNA末端，就可以连接成重组质粒2．人工接头的应用人工接头是一个合成的含有特定限制酶识别顺序的核苷酸片段。

EcoRI

↓CCGAATTCGGEcoRI

GGCTTAAGCC

人工接头↑

EcoRI

＋T4DAN连接酶人工接头EcoRI外源DNA粘性末端用于连接载体人工接头的应用

四、载体Vectors能使克隆的片段不断复制的一类DNA分子称载体，应具备以下特点：（1）分子量小，核苷酸序列清楚，具有一些单一酶切位点或人工插入的多克隆位点区。（2）分子中具有一个复制起始点，能使载体自身和插入的外源DNA共同复制。（3）具有易于筛选重组分子的标志，如抗药性。

(4)比较容易从宿主细胞中回收1．质粒：

双链环状DNA分子，能经转化导入E.celi中优点：能使宿主细胞产生抗性，便于选择质粒，在细胞中的拷贝数多。

Acolor-enhancedelectronmincrographofcircularplasmidmoleculesisolatedfromthebacteriumE.coli..TheplasmidpUC18offersseveraladvantagesasavactorforcloningCloningwithaplasmidvector.16-9利用LacZ基因的插入失活筛选重组子

许多载体的多克隆位点区插入在LacZ基因区中。LacZ基因编码β-半乳糖苷酶的一个亚基，它可以使携带载体的细菌在含有X-gal（能被β-半乳糖苷酶水解的底物）的培养界上形成蓝色的菌落。当外源基因插入到多克隆位点区后就阻断了LacZ基因的编码区，使LacZ基因失去了功能，因此，凡是插入了外源基因的重组质粒进入宿主细胞后，这些细胞就不能利用X-gal，结果在培养基上形成白色的菌落。挑选出白色菌落可作进一步鉴定。

APetriplateshowingthegrowthofbacterialcellsafteruptakeofrecombinantplasmids.16-6菌落原位杂交筛选和鉴定克隆的基因根据重组质粒中的目的基因的序列，合成一段与之互补的DNA序列，并使其标记上放射性同位素，该段DNA称为探针。再用探针与菌落中的DNA进行杂交，可从许多未知的菌落中挑选出克隆有目的基因的菌落。2．λ噬菌体它的头部通常能包装进45kb长的DNA分子，基因组中间部分是裂解性生长的非必需区，因此在其区域内转换插入大的外源DNA片段可以不影响其复制功能。

3．单链病毒在感染E.coli过程中，感染性单链能转变为双链的复制型。分离这种复制型的双链可用作克隆的载体。这种噬菌体用作克隆的优点：在重新感染合适的宿主时，它产生的噬菌体颗粒是单链DNA，为DNA序列分析提供方便。4．表达载体ExpressionVectors具有合适的转录和转译起始信号，外源基因插入合适的区域后能够表达的载体。某些载体质粒既具有E.coli的复制起始区，又具有动物病毒SV40的复制起点，这样的质粒既可在E.coli中复制，又可在培养的动物细胞中复制，应此称为穿梭载体。ShuttleVectors第四节重组DNA方法学

一、克隆战略

1．无选择地从一个限制酶切的混合物中克隆全部片段，然后再筛选所需的目的基因。

非选择性地在细菌中克隆一个高等生物的随机DNA片段的方法称为鸟枪法（Shotgunning），全部克隆的集合体称为一个基因文库（genebank,orgenelibrary）。组成一个基因文库的全部重组质粒或全部重组噬菌体代表了一个生物整个基因组。2．用一目的基因的一个探针从整个DNA酶切片段的集合体中选出合适的酶切片段，然后再克隆特定的片段。组成一个基因文库的全部重组质粒或全部重组噬菌体代表了一个生物整个基因组。二、鉴定克隆的基因1．用特定的内切酶消化重组质粒，电泳比较切出片段的大小。2．SouthernBlotting

酶切和电泳只能对重组克隆作出初步鉴定，可得知克隆片段的大小但尚难确定克隆片段是否目的基因。Southern发明了一种对电泳凝胶中的DNA作分子杂交鉴定的方法。该方法可用于重组质粒鉴定，转基因生物中外源基因的插入位置，遗传病的分子诊断等。单链DNA能结合到硝酸纤维滤膜上，酶切物经电泳后，琼脂糖胶作变性处理，然后将DNA吸印到膜上，用32P标记的DNA或RNA探针与膜上的DNA作杂交，自显影后可显示出目的基因的位置和大小。TheSouthernblottingtechniquesouthernblotafterhybridization,exposure,anddevelopment.ThebandsshowDNAfragmentscomplementarytothenucleotidesequenceoftheprobe.3．用cDNA克隆作探针，从基因文库中筛选目的基因克隆。

用反转译酶从mRNA制备cDNA，全部cDNA片段与质粒载体相连，转化E.coli得到的全部克隆称为cDNA文库。*一个基因的cDNA克隆和genomic克隆可能在大小上有很大区别，为什么？4．直接分析克隆基因表达的蛋白在生物的不同器官和组织，或在细胞的不同的分化阶段会有某些特定基因的表达，此时细胞中的特定基因会特异性转录成特定蛋白的mRNA，因此可用反转录方法获得该基因的cDNA。用反转录酶从mRNA合成cDNA；全部cDNA片段与载体相连并转入细菌细胞获得的全部克隆称cDNA文库，再从cDNA文库中调出目的cDNA克隆。

思考题：假定人生长激素基因的cDNA(1kb)已经插入在某一载体的BamHI和EcoRI的酶切位点中，该克隆大小为5kb。例举两种鉴定该基因的具体方法，要求写出实验步骤，并且用图表示鉴定结果。

三，克隆基因的定点诱变□

意义：基因的功能通常是通过其突变体来认识其作用的。在重组DNA技术中常需研究DNA序列上特定部位的功能，或改变基因编码区个别氨基酸的密码子以提高该基因表达蛋白质活性等。

□定义:特异性地改变某一基因的方法称定点诱变site-directedmutagenesis

克隆基因的定点诱变

根据基因中欲改变位点的核苷酸序列设计一段引物，引物中含有突变的碱基。在聚合酶作用下，合成一条互补的含有突变基因的链，将杂合双链引入大肠杆菌细胞，经复制后会产生一个野生型和一个突变型基因的细胞，再用分子杂交法作鉴定。思考：如何用分子杂交法筛选和鉴定一个野生型和一个突变型基因？第五节DNA序列分析

DNA序列分析是最终了解基因结构和组成的重要工具,在人类基因组计划中测定人基因组的全部核苷酸序列是该计划的核心。1977年Sanger发明了以双脱氧核苷三磷酸（2’3’ddNTPs）作为DNA合成终止剂的“末端终止法”，开创了基因核苷酸序列测定的先河，最早完成了Φ×174全部序列的测定。为此Sanger第二次获得诺贝尔奖。发现了重叠基因

Sanger等最早对Φ×174病毒作DNA序列分析，该病毒基因组全长5400bp，共编码9种蛋白质，但根据该9种蛋白质分子量推算其编码区，明显超过病毒基因组5400bp长的核苷酸所能编码的容量。如何解开这个谜？Sanger回答了这个问题：在基因组中存在重叠基因！重叠基因定义：在一种蛋白质的核苷酸编码序列中包含了另一种蛋白质的编码序列，所不同的是各自以不同的读码框转译。Φ×174病毒的重叠基因如下：

ABCDJFGHE重叠基因概念与密码子的非重叠性

Sanger采用独创的序列分析方法对Φ×174病毒基因组作序列分析，提出了令世人惊讶的重叠基因概念，是对基因认识的重大发展。重叠基因是利用两种不同的读码框架编码两种不同的蛋白质，在每一读码框中密码子解读仍是不重叠的。如下图：

aa1aa2359

6061

62

63149150151152↑

ATGAGTCAA……GTTTATGGTACGCTG……GAAGGAGTGATGTAA

175189445aa1aa23

4

8990↓

基因E开始基因E终止↑基因D开始基因D终止Sanger序列分析方法原理采用单链DNA（或将含有外源基因的重组质粒DNA变性），在引物和DNA聚合酶的作用下，在四组独立的反应中除加有4种dNTPs外（其中之一为同位素标记），再分别加入4种ddNTPs中的一种作为链延伸的终止剂，结果将在四组反应管中产生长度不等的4组寡核苷酸链，它们分别终止于被测链的每一个A、G、C或T。如在加有ddATP的反应管中产生的是一系列以A为结尾的寡核苷酸链；在加有ddGTP的反应管中形成的是以G为结尾一组寡核苷酸链等等，再经聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜和放射自显影即可从放射自显影胶片上读出DNA序列。OBase

HHO=P–P–P–O

OOO

OOO2’、3’ddNTP的结构，注意其3’位置是一个H而不是OH，因此后续的脱氧核苷酸不能接到3’位上从而造成链的终止。SangerDNA序列分析示意图

DNAsequencinggelshowingtheseparationoffragmentsinthefoursequencingreactions(oneperlane).InDNAsequencingusingdideoxynucleotideslabeledwithfluorescentdyes,allfourddNTPsareaddedtothesametube,andduringprimerextension,allcombinationsofchainsareproduced.16-20AutomatedDNAsequencingusingfluorescentdyes,oneforeachbase.思考题：假定某一克隆基因的部分序列为5，—TCACGTAAGT—3，，试根据Sanger序列分析方法原理画出测定上述序列的放射自显影示意图，并对示意图作必要的标注和解释。第六节基因工程

由基因工程方法产生的生物称为转基因生物，它一般是指由导入外源DNA的细胞发育而成的生物。

基因工程

□

定义：根据分子生物学和遗传学的原理，将一种生物的遗传物质DNA转移到另一生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达出所需要的产物。一、利用微生物基因工程生产重组基因工程药物利用基因工程技术不但能得到大量的具有特殊功能的基因。而且可以让这些特殊功能的基因生产出具有特殊功能的蛋白质药物，这是目前基因工程领域中最活跃最有成果和极富商业价值的领域之一，究其原因：（1）蛋白质和多肽是基因表达的直接产物，可用重组DNA技术进行研究和生产。（2）具有生物活性的蛋白和多肽是珍稀而具有很高医疗价值的药物，用常规分离的方法很难制取。目前有几十种基因工程药物，常用的有：干扰素、白细胞介素、乙肝疫苗、人胰岛素和人生长激素等。人类最早的商业化基因工程药物是人胰岛素和人生长激素，于80年代初投放市场，用大肠杆菌来生产，是基因工程

发展的里程碑。□胰岛素是治疗糖尿病的重要药物，之前从猪或牛的胰腺中提取分离，含量少而且会有毒素。□人生长激素是治疗侏儒症，青少年增高和促进创伤组织修复的药物，生长激素具有种属特异性，从动物脑组织来源的生长激素不能用于人类，之前只能从刚死亡的人大脑垂体中分离纯化，来源极有限；而且发现长期应用会对人类有毒副作用。Themethodusedtosynthesizerecombinanthumaninsulin.19-15溴化氰例子大鼠肝脏F抗原蛋白基因在大肠杆菌中表达

F蛋白定位在肝细胞浆中，正常人肝组织中的F蛋白含量是血清中1370倍，只有肝细胞被破坏时，F抗原才释放到血浆中，使血清中F抗原含量升高，

F抗原用作肝病诊断，首先需获得纯的F抗原。目前国内外大多采用生化提取的方法从人肝脏组织中分离F抗原，由于难以得到F抗原纯品，给大量制备诊断试剂带来困难。利用原核（大肠杆菌）表达系统，成功表达了大鼠肝脏F抗原，表达产物经SDS，Western-blot分析，分子量为43kD，同时具有F抗原的免疫学活性，可作为一种基因工程产品用于今后的免疫检测工作。方法：基因克隆。提取大鼠肝脏总RNA，对其进行反转录和PCR（RT-PCR）扩增出目的基因（F-antigen’scDNA），然后将其与pET-15b载体进行连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)plyss，在含氨卞青霉素和氯霉素的培养基上筛选转化子。将酶切结果正确的表达质粒命名为pET15b-F。

表达载体pET15b-F构建示意图F抗原表达经IPTG诱导后，含表达载体pET15b-F的表达菌株表达出一外源蛋白，该蛋白大小在43kD左右，与文献报道大鼠F蛋白大小一致。且在该表达系统中得到高表达，外源蛋白表达量约占全菌总蛋白的40%。F抗原纯化与鉴定

离心后所得包涵体蛋白经过初步纯化和溶解后，经过亲和层析柱（Ni2+-chargedIDAHis-bindcolumn）纯化，得到一分子量约为43kD的单一蛋白带（Fig.A泳道8）。表达产物的Western-blot鉴定结果显示：该表达蛋白可与豚鼠抗人F蛋白的抗血清发生特异性结合反应，在硝酸纤维素膜上呈现一条分子量为43kD的显色带（Fig.B）

SDSandWestern-blotoftheexpressedFAntigen(A) 1.Proteinmolecularweightstandard;2.pET15b-FinducedbyIPTG;3.inclusionbodyofthelysate;4.supernatantofthelysate;5.pET15b-Fnon-inducedbyIPTG;6.pET-15binducedbyIPTG;7.non-plasmidinducedbyIPTG;8.purifiedtargetprotein(B)Western-blotofthepurifiedtargetprotein.GuineapigpolyclonalantiserumagainsthumanFantigenwasusedasprimaryantibody.(A)12345678(B)二、用真核细胞表达和生产基因工程药物

虽然用大肠杆菌细胞表达基因工程药具有许多优点，如成本低等，但由于原核系统表达的真核基因蛋白有时缺乏生物活性，其原因由于原核生物缺乏合适的转译后修饰机制。因此用真核细胞表达和生产基因工程药物已受到重视。□真核细胞反应器：外源基因在合适的载体带动下转染进入体外培养的哺乳动物细胞，昆虫细胞或酵母细胞，通过大规模培养细胞表达外源基因。几种重要的基因工程药物已可用真核细胞反应器完成治疗癌症抗病毒预防病毒性肝炎治疗血友病治疗贫血症治疗心脏病促生长，增强免疫功能

酵母菌酵母菌哺乳动物细胞哺乳动物细胞哺乳动物细胞昆虫细胞

α干扰素乙肝疫苗集落刺激因子红细胞生成素组织溶纤酶原激活剂人生长激素

应用细胞名称

昆虫细胞杆状病毒表达系统(InsectcellandBaculovirusExpressionSystem)

是一种高效的真核细胞表达系统杆状病毒因其病毒粒子呈棒状或杆状而得名。苜蓿尺蠖核型多角体病毒(Autographacalifornica

multiple

nuclearpolyhedrosisvirus，AcMNPV)作为杆状病毒-昆虫细胞真核基因表达系统的载体被广泛应用。1.幼虫吞食了感染有多角体的食物,多角体在消化道的碱性环境下溶解，释放出病毒颗粒，2.每个病毒颗粒的脂蛋白外被又与肠壁细胞的质膜相融合，最终将核壳体释放至胞质中，核壳体再将自己的DNA转入细胞核内。3.在感染后12h采用出芽方式离开宿主细胞，在跨过宿主细胞的质膜时，以宿主的质膜形成自己的外被，形成表型为出芽型病毒粒子（buddedvirus,BV），生活史

PolyhedrinProteinVirionEnvolopeNucleocapsidcross-sectionNucleocapsidLongitudinal-sectionPolyhedronenvelopeDNA-蛋白复合体由39KD衣壳蛋白外被所包围，形成一个核衣壳，若干个核衣壳外面再包被一层脂蛋白外被就成为病毒颗粒。几个病毒颗粒聚集成一簇，嵌在晶状基质中成为一个多角体包含体。多角体包含体的组成ƀ杆状病毒基因表达的级联式时序调控杆状病毒的基因表达分为4个时期：极早期（immediate-early,α）、晚早期(delayed-early,β)、晚期(late,γ)和极晚期(verylate,δ)。通常，每一后续时期基因的表达水平都高于前一时期基因表达的水平，其中极晚期基因表达水平显著提高，这也是构建杆状病毒表达载体的基础。如Fig所示。

FigSchematicrepresentationofthefourphasesofbaculovirusgeneexpressioninvitro多角体蛋白P10蛋白由于多角体蛋白基因及P10蛋白基因具有非常高效的启动子，同时由于这两个基因的产物不参与感染病毒颗粒的形成，可以从病毒基因组中去除而不会对病毒的复制及感染造成影响。由于这两个特点，使人们得以设计利用杆状病毒启动子在昆虫细胞中表达外源基因.杆状病毒表达载体构建由于AcMNPV基因组的巨大，不可能用单一的限制性酶来对它进行操作，所以目前使用的杆状病毒表达载体系统大多采用构建转移载体（transfervector）的方法。将带有外源基因的转移载体DNA和野生型病毒DNA共转染体外培养的昆虫细胞，使得转移载体与野生型病毒发生同源重组，外源基因取代多角体基因，如Fig所示。通过重组病毒空斑纯化得到能表达外源基因的重组病毒。

TransfervecterPpClonedgenePt5,3,PolyhedringeneAcMNPVDNARecombinantAcMNPVFig.共转染发生同源重组获得重组病毒

野生型病毒感染的昆虫细胞由于存在多角体基因，空斑测定时产生有多角体的空斑（occ+）。重组后由于多角体蛋白基因已被外源基因所取代，只能产生无多角体的空斑（occ-）。在光学显微镜下根据折光率的不同可区分这两种不同表型的空斑。由此经过几轮的空斑纯化即可获得多角体缺陷的重组病毒。用重组病毒感染宿主细胞，感染后期得到外源基因的高效表达。与野生型病毒共转染培养的昆虫细胞

用磷酸钙沉淀法将重组转移载体质粒pVL1393-hGH与野生型病毒AcMNPVDNA共转染贴壁培养状态良好的Sf9细胞，由于pVL1393多角体启动子两侧存在与多角体基因同源序列，可与野生型病毒基因发生同源重组，从而使人生长激素基因替代野生型病毒中的多角体蛋白基因，得到重组病毒rAcV-hGH。

重组病毒的Southern杂交鉴定，hGHcDNA整合进杆状病毒基因组的正确位置中表达产物的SDS与Western-blot分析三、植物基因工程□定义：将外源目的基因导入体外培养的植物组织或细胞，通过组织或细胞培养使之发育成完整的再生植株——转基因植株。1.冠瘿瘤——天然的植物基因工程自然界某些植物受到农杆菌的侵染会形成肿瘤——冠瘿瘤。其形成的机理是由于农杆菌中含有的一种诱发肿瘤的质粒所引起的，称为Ti质粒（tumor-inducingplasmid，简称Ti质粒）。Ti质粒上的一段DNA能转移到侵染的植物部位细胞中，并插入到植物染色体中，由于该片段（称T-DNA）上具有诱发肿瘤的基因，所以能诱发植物产生肿瘤。T-DNATumorproductionNopalinesynthesisT-DNAtransferfunctionNopalineutilizationOriginofreplicationTiplasmidTi质粒（胭脂碱型）简图冠瘿瘤——天然的植物基因工程2.农杆菌Ti质粒作为植物基因工程载体科学家根据冠瘿瘤形成的分子机理，通过改建农杆菌Ti质粒，使Ti质粒中的致瘤基因失活，同时插入目的基因，使之成为基因工程载体。通过感染转化植物组织和细胞，并使之培养成完整的植株。CointegrateTi-plasmidTobaccoplantcellTrasformedcellCulturedcellPlantletTransgenictobaccoplantCelloftransgenicplant植物基因工程程序图3.抗除草剂基因工程(Genetransferofglyphosateresistance)

草甘膦在低浓度时非常有效，对人无毒，可被土壤中微生物分解。草甘膦能被植物细胞的叶绿体的酶（EPSP合成酶）所分解，该酶对细菌和植物中的氨基酸的合成很重要，没有这种酶的作用，植物就会干枯和死亡。从抗草甘膦的细菌中分离和克隆EPSP合成酶的基因和抗除草剂基因工程

抗除草剂基因工程示意图首先从抗草甘膦的细菌中分离和克隆EPSP合成酶基因，再进行植物抗除草剂基因工程GenetransferofglyphosateresistanceTobaccoleavesexpressingthehepatitisBantigen.转基因植物叶片表达乙肝病毒表面抗原。叶片用抗乙肝病毒表面抗原的抗体处理的结果。

正常叶片4.具有易于长期保鲜的转基因西红柿的制作过程原理如下：

通常的西红柿不易保存保鲜，这是由于一种蛋白酶的催化成熟的结果。将这种酶的基因分离出来，再根据该基因序列结构合成它的互补基因，再将这种互补基因转入到西红柿植株中，它将会产生出一种与上述蛋白酶基因正常转录的mRNA相互补的mRNA（称反义RNA），并且与之结合成双链，使之不能正常翻译成催化西红柿成熟的蛋白酶。未成熟的西红柿易于长期保存保鲜和运输。只需用乙烯处理后即可成熟供应市场。转基因西红柿的途径

5．植物细胞的转化方法（1） 叶圆片共培养转化（2） 单细胞水平上的转化在Kan培养基上选择转化的组织——再生植株。5．转基因植株的遗传以孟德尔比例传递。转基因植株的一对染色体

Kan自交1/4Kans1/2Kanr1/4Kanr思考题：

Kanr能在转基因植株中以组成型的方式表达，如对转化植株的花药作培养所得花粉植株抗性和敏感性比例如何？转化植株自交或与野生型回交的结果如何？

四.转基因动物

1.定义:转基因动物是指以实验方法导入外源基因,并在其基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物.

2.意义:(1).建立转基因动物模型以研究外源基因在整体动物中的表达调控规律;(2).改变动物基因型使其表型更符合人类需要;(3).可用转基因动物产生人类需要的生物活性物质.转基因生物反应器

□定义：将目的基因导入动物体内形成转基因生物，由于基因表达，可以从转基因动物的特定组织或器官（乳汁、血液等）获得目的基因产物。使转基因动物象一个活的发酵罐一样来生产目的基因的产物。采用上述方法获得的转基因羊，可从羊奶中提取出治疗心脏病的药物tPA（组织溶解酶原激活剂）。

转基因的方法:按基因导入方式划分,建立转基因动物主要有：显微注射法,反转录病毒感染法胚胎干细胞法.显微注射与反转录病毒感染方法都是把DNA直接导入受精卵或在不同的发育阶段.受精卵四细胞胚胎囊胚原肠胚

转基因动物

显微注射

反转录病毒感染

DNA

DNA

在受精卵不同发育阶段的转基因方法转基因动物的应用研究遗传疾病的基因治疗人类伦理道德一般不允许直接对人的受精卵进行基因操作，一般是将处理过的体细胞移植到患者体内。但这种操作具有一定的危险性，必须首先在动物体内进行试验。所以，通过培育缺陷性状得到矫正的动物(或细胞)可以为这类疾病的基因治疗提供动物(或细胞)模型。

基因剔除技术

研究人类基因功能的重要手段是基因敲除。由于人和老鼠的基因非常接近，因此当怀疑人类基因图谱中的某一片段同某种疾病相关时，就将老鼠体内的这个基因去除掉，看它会长成什么样。

如果没眼，那么被去除的基因就是决定长眼的基因。

基因敲除（geneknockout）是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上将该基因去除，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。基因敲除还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突变基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。基因敲除的应用领域主要有：1、建立人类疾病的转基因动物模型基因敲除小鼠是研究疾病的发生机理、分子基础及诊断治疗的重要实验材料。2、改造动物基因型，研究基因敲除小鼠在胚胎发育及生命各期的表现，可以得到该基因在生长发育中的作用，为研究基因的功能和生物效应提供模式。3、治疗遗传病去除多余基因或修饰改造原有异常基因以达到治疗的目的.五.动物克隆技术克隆的基本概念

克隆是英文clone的译音，最早来自希腊字clonos，意指树枝条。动词clonizos是砍树枝。名词clone意指无性繁殖（系），作为动词意指产生无性繁殖系的过程，所以clone可以称为无性繁殖或复制

现在的克隆技术可分为三个层次：基因、细胞、个体。.

克隆技术的生物学基础——细胞及细胞的全能性根据细胞学说，细胞是一切生物体的结构和功能单位，无论是进行有性繁殖还是进行无性繁殖的生物，都是有细胞构成的。要突破生物有性繁殖和无性繁殖的界限应该从它们的共性出发，从操作细胞开始。克隆技术所依赖的理论基础19世纪30年代提出细胞学说，细胞是生物有机体的结构和生命活动的单位，又是生物个体和系统发育的基础，1902年Haberlandt提出植物细胞全能性的设想。根据细胞理论，提出高等植物器官和组织可以不断分割直至单个细胞的观点。

细胞全能性（Celltotipotency）：任何一个处于细胞分化临界期之前的细胞，只要处于合适的条件即可以发育为完整的生物体，也可以发育成任何组织或器官等。例如植物体的每个细胞都具有在离体条件下诱导分化形成完整植株的能力，这是由于每个细胞都具有完整基因组实现的。

植物细胞全能性实验的重要事件：

1.

Steward，1958，从胡罗卜根游离单细胞培养成完整植株。2.Guha，1964，曼陀罗花药培养成单倍体植株。

3.Takebe，1971，烟草原生质体培养成植株。

动物细胞的全能性？长期认为在动物发育的早期胚胎阶段，每个胚胎细胞都具有全能性，但是随着胚胎发育，胚胎细胞逐渐失去了这种全能性而开始功能分化，有的发育成神经组织，有的发育成肌肉组织。关键的问题是：动物细胞的分化过程是不可逆的吗？1.动物克隆的早期设想：1938年，德国胚胎学家HansSpemann提出了用成年体细胞的核移植到未受精的卵细胞中，来实现动物的无性繁殖，未成功2.从低等动物开始，两栖类和鱼类1952年RobertBriggs和ThomasJKing用囊胚核移植方法产生了蝌蚪，未生成青蛙。1962年Gurdon用成年蛙体细胞克隆出青蛙，1965年童第周完成了金鱼的核移植成功。3.1984年SteenWilladsen成功利用胚胎细胞的细胞核移植到未受精的卵细胞中产生了一头绵羊，后来有小鼠，兔，山羊，牛，猪等克隆成功。4.以后长期用较晚期胚胎细胞和体细胞核移植一直失败，产生了一种观点：用高度分化的动物体细胞进行克隆在生物学上是不可能的?5.Wilmut，1997年，用绵羊乳腺细胞核移植，实现了在去核卵细胞中重新编程（Reprogramming），开创了高等动物体细胞克隆新时期。动物克隆技术的发展经历从胚胎细胞的克隆（包括胚胎切割）到体细胞克隆的过程

胚胎细胞克隆技术产生的新个体并非是亲代的自我复制，而是多生了几个双胞胎，并未引起世人注意。体细胞克隆可达到亲代个体的自我复制。

□核移植技术将供体复制对象的细胞核转入到去掉细胞核的卵细胞中。由于体细胞包含有全部的遗传信息，可以从体细胞获得完整的动物个体。克隆羊“多莉”的诞生说明动物体细胞也具有全能性，因此它是真正意义上的动物克隆，动物克隆的基本过程以克隆羊为例，动物克隆的基本过程如下图

克隆动物的应用：1.快速克隆出优良的种畜和遗传上一致的实验动物；2.动物资源的种质保存，包括地球上频危动物的挽救等（异种核移植）；3.生产移植器官；4.与转基因技术相结合研制生物反应器生产基因药物。

转基因体细胞克隆技术比转基因动物（通过原核注射）的方法优越：后者整合率和表达率低，经常出现嵌合体。

5.克隆人。是全世界注目的焦点，有人设计了克隆人的技术路线

动物克隆中急待解决的问题1.成功率低(1-3%)2.供体核和受体胞质细胞周期的同步化是影响克隆胚胎发育的重要因素.

3.线粒体来源的问题:发现有些克隆动物的线粒体(mtDNA)为杂合体,既有受体胞质的,也有供体细胞来的.4.端粒酶的问题：正常细胞没有端粒酶，所以端粒会随着细胞分裂而变短，细胞衰老。那么克隆动物是否会随着供体细胞的缩短的端粒而提前衰老呢？有发现Dolly羊的端粒限制性片段平均长度（meanterminalrestrictionfragment,TRF)比同龄对照短。供体细胞培养时间越长，TRF越短.□

动物克隆的危险性：1．克隆动物已出现广泛的免疫缺陷或早期夭亡。2．克隆动物过程中也极有可能产生遗传性的变异（无性系变异），这在植物的克隆中已广泛得到研究和验证（会发生染色体变异，基因组DNA扩增和某些转位因子的激活）。第七节遗传病——基因诊断和基因治疗

一、基因诊断

□

感染性疾病的诊断：人类感染了外源的病毒、细菌等引起的传染性疾病的诊断可以直接分析患者的组织、器官或血液等来确定是否有外来病源性生物的基因。如HIV的DNA序列已经搞清，可以根据该序列设计合成一段引物，再从受检人的血液或组织中抽提极微量的DNA为模板进行DNA的扩增，如获得与HIVDNA序列相同的特定长度的DNA片段，即可确定受检者携带HIV病毒。□

人类遗传性疾病的产前诊断

人类有200多种遗传病可用基因诊断技术作出准确的诊断，甚至在发病前和出生前作出诊断。如胎儿的羊水和胎盘绒毛细胞可从母体内取得，取出的细胞可以进行染色体核型、性别、生化和基因组缺陷的检测1．检测限制性位点的变化（1）镰形细胞贫血症是编码血红蛋白β链的一个决定谷氨酸的密码子GAG变成了编码缬氨酸的密码子GTG，从而使血红蛋白质分子结构和功能发生根本的改变，该患者的红细胞由正常的园盘形变成镰刀形。正常红细胞镰形红细胞

（2）检测原理：由于血红蛋白基因上单个核苷酸的替换（A→T），使该部位的正常序列由CCTGAGG变成CCTGTGG，从而使患者DNA中消失了一个可被特定内切酶（MstII）切割的切点。MstII识别的序列为CC↑TNAGG。下图为正常和异常蛋白、基因和内切酶识别位点变化图。β—珠蛋白基因——————————————————/////////内含子///////////////////////////——————————————————↑0.2kb↑

1.1kb↑

M

M

M

（在异常中消失）

—脯——缬——谷——CCT—GTG—GAG—

MstII识别位点消失异常S—脯——谷——谷——CCT—GAG—GAG—

MstII识别位点正常A氨基酸序列和基因序列

血红蛋白类型

(3).Southern杂交检测镰形细胞贫血症提取羊水或绒毛细胞DNA，用限制性内切酶MstII对DNA酶解，经电泳和Southern吸引转膜后，用放射性标记的β-株蛋白基因探针对膜上的DNA作杂交，根据经放射自显影后的胶片上杂交斑点的多少和位置可作出诊断：正常人的β-珠蛋白基因（βAβA）中有3个MstII切点，可将该DNA上切成2个片段，它们为0.2kb和1.1kb长，因此会在相应位置产生二条杂交带；异常患者的β珠蛋白基因（βSβS）中，只有2个切点，可将该DNA切一条长1.3kb的片段。突变携带者（杂合子），其β-珠蛋白等位基因中，一个是正常的基因，它有3个切点，切成2个片段；另一个携带突变的基因片段中只有2个切点，产生一个大的片段。(4).Southern杂交检测结果

2、异常序列检测(allele-specificoligonucleotides,ASO)如果某一特定核苷酸发生异常，可用在该基因相应区段上正常的野生型序列的寡核苷酸作为探针，经Southern杂交确定：杂交时的温度是重要条件。因为野生型和突变型只差一个核苷酸，都可能与正常野生型探针杂交。在较高温度时，互补序列才能杂交，只有一个错配碱基的DNA也不能杂交。Genotypedeterminationusingallele-specificoligonucleotides(ASOs).19-73.PCR检测法用Southern杂交法对镰形细胞贫血症作产前诊断需要足够的细胞，并需提取纯化DNA，并作酶切和杂交等步骤，不但所需时间较长，而且有一定的风险。PCR法：根据β-珠蛋白基因序列设计二条引物；取得极微量胎儿绒毛细胞或患者血液，裂介细胞粗提DNA，然后作PCR扩增，无论是正常或异常者都会产生1.3kb长的DNA片段。再对扩增样品作酶切和电泳，其结果可直接从电泳图获得：该法简便，只需微量细胞就可作出诊断。正常异常携带者1.3电1.1泳↓0.2□

PCR原理（1）变性，在95℃高温下模板双链DNA解开成单链DNA。（2）退火，将反应系统降至55℃，使引物能与模板单链DNA的特定部位配对结合。（3）链延伸：在72℃，以单链为模板，在引物的3’末端以互补原则合成新链。每一周期可使目的基因扩增一倍，经30个周期可扩增230目的基因片段。PCR技术是DNA操作的重大发明，Mullis等获得了1993年诺贝尔奖。基因芯片技术（DNAmicroarraysorDNAchips)

□概念：基因芯片技术是DNA杂交探针与半导体工业技术相结合的产物。将各种探针固定于支持物上后与带有荧光标记的DNA样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号，进而获取被测样品中DNA分子的数量和序列信息。该技术可用于大规模筛查由基因突变引起的疾病。□检测原理和步骤：

(1)．制作芯片：根据疾病基因中的突变位点区域的核苷酸序列合成20个核苷酸长的探针，将其固定于芯片上，芯片上可固定成千上万个探针。（2）．从被测对象的细胞中提取DNA，用酶切成较小的片段，并对DNA作荧光标记，并熔解成单链。（3）．将样品滴加到芯片上并与芯片上的探针杂交，凡是与探针互补的酶切片段会固定于特定位置上，不能互补的片段会被洗脱掉。（4）．对芯片上的荧光作扫描和分析。GenescreeningusingaDNAmicroarray.

遗传咨询的若干伦理问题

遗传病的定义

遗传病是由于遗传物质发生改变而造成的疾病，它可在上下代之间按一定的方式垂直传递，并且在有血缘关系的个体间由于遗传继承，有一定的发病比例。遗传疾病的分类（一）染色体病（二）单基因遗传病（三）多基因遗传病遗传病的发病率有增高趋势1956年活婴中有先天性缺陷患儿的比例约4‰；1968年活婴中有先天性缺陷患儿的比例约6‰；1977年活婴中有先天性缺陷患儿的比例约10.8‰；遗传病本身具有的严重性遗传性(hereditary):

患者家庭的上、下垂直发病或同代间的水平发病，家系中往往有多个发病的个体；先天性(inborn):

在胎儿期即存在遗传损害，生后即出现缺陷，给预防和治疗造成极大的困难；终生性(lifelong):

患者受累终生直至死亡（AR）（AR）（AR）（AD）（XR）（线粒体病）遗传服务中应遵循的伦理学原则遗传服务的四大伦理原则尊重自主行善无伤害公正产前诊断中涉及道德问题上的4项基本准则

尊重夫妇双方的选择对个人和家庭不产生伤害产前诊断的结果可靠产前诊断和遗传咨询的自愿性二、基因治疗（genetherapy）

人类的遗传性疾病治疗的常规方法：（1）手术治疗，如先天性心脏病通过手术加以矫正.（2）药物治疗，如生长激素缺乏症（侏儒）可注射人生长激素等。□基因治疗定义：应用基因工程手段用正常基因导入基因有缺陷的靶细胞中，使正常基因表达，并合成相应的产物，使细胞恢复正常的功能，使疾病得到治疗。□基因治疗的类别：根据基因转移到受体细胞的不同，可分为体细胞基因治疗和生殖细胞基因治疗。（1）．体细胞基因治疗：将正常的外源基因导入到患者特定的体细胞中，并使其正常表达，合成患者所缺的某种蛋白质或酶，使患者的症状得以改善。（2）．生殖细胞基因治疗：将正常基因导入患者的生殖细胞、受精卵或早期胚胎细胞中，使这类细胞中的某些异常基因的功能得以恢复，最终发育成正常个体。1.基因治疗方法和步骤

(1)．通常将正常的基因首先与基因转移的载体相连接，常采用的载体有反转录病毒载体和腺病毒载体。(2)．将患者的体细胞（称靶细胞）作体外培养，常用的有T淋巴细胞，骨髓干细胞，皮肤成纤维细胞、肌细胞、肝细胞等(3)．外源基因的转移，将外源基因通过载体导入到靶细胞中，常用转染的方法（加入磷酸钙）导入到细胞中，并与细胞中核DNA整合到一起，也可用重组病毒感染靶细胞转移外源基因。(4)．对能正常表达目的基因的靶细胞作检定后回输到患者体内。

重症联合免疫缺陷（Severecombinedimmunodeficiencydisease，简称SCID），患者缺乏正常人体免疫功能，其染色体上编码腺苷脱氨酶（简称ADA）的基因发生突变所致。由于ADA是嘌呤代谢中的一种酶，该基因缺陷将导致患者身体细胞中脱氧腺苷的累积，达到高浓度时脱氧腺苷将对免疫系统细胞（如T-细胞