第三章动物细胞工程制药

动物细胞工程制药第三章生物技术制药第一节概述细胞学说的建立组织培养和细胞培养细胞工程学第二节动物细胞的形态

和生理特点

一、动物细胞的形态适应功能,形态各异。离体培养细胞分两类：贴壁细胞悬浮细胞⒈贴壁细胞

生长须有贴附的支持物表面，自身分泌或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长。两种形态：成纤维细胞型上皮细胞型⒉悬浮细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如淋巴细胞。⒊兼性贴壁细胞生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。二、动物细胞的生理特点⒈细胞的分裂周期长细胞分裂时间为12～48h，细胞的分裂周期=间期+分裂期间期（G1+S+G2）分裂期（M）G1期：4～6h合成DNA聚合酶

RNA合成S期：6～8hDNA合成G2期：2～5hDNA量加倍,RNA合成M期：0.5～1h染色体分裂细胞代数为细胞分裂次数传代数表示细胞培养分种传代次数细胞代数=传代数×分种数/2X=(logN-logNo)÷log2X代数

N培养最终细胞数

No培养起始细胞数倍增时间=培养经过时间÷代数⒉细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制现象。⒊正常二倍体细胞的生长寿命是有限的。原代培养有限细胞系无限细胞系⒋动物细胞对周围环境十分敏感;

对理化因素敏感，如：渗透压、pH、离子浓度、剪切力、微量元素等。⒌动物细胞对培养基要求高必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、葡萄糖、细胞生长因子、贴壁因子等。

⒍动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。动物细胞蛋白质的合成部位：游离核糖体粗面内质网的核糖体

游离核糖体合成蛋白质用于细胞质基质内。

粗面内质网的核糖体合成蛋白质是分泌的和膜中的整合蛋白多为糖蛋白。动物细胞生产药物缺点:培养条件高、成本贵、产量低。优点:分泌胞外、纯化方便、翻译后修饰糖基化，与天然产品一致。第三节生产用动物细胞的

要求和获得一、生产用动物细胞的要求原代细胞二倍体细胞系转化细胞系二、生产用动物细胞的获得⒈原代细胞是直接取自动物组织器官,经过粉碎消化而获得的细胞悬液（109/g）。需要大量动物，费钱费劳力。鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、淋巴细胞。⒉二倍体细胞系原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细胞成分的组织中，挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。二倍体细胞有正常细胞的特点：①染色体组型是2n核型；②贴壁依赖接触抑制；③可传代培养50代；④无致瘤性。二倍体细胞⒊转化细胞系通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。转化过程可以是自发的，和人工的，从肿瘤组织中。三、常用生产用动物细胞

的特性

W1-38：正常胚肺组织人二倍体细胞系。核型为2n=46。成纤维细胞，能产生胶原，培养基用BME（Eagle’Basalmedium）。10%小牛血清，pH7.2,同工酶为G6PDB型。倍增时间为24h，有限寿命50代。安全，用于制备疫苗。

MRC-5：从正常男性肺组织中获得的人二倍体细胞系。核型为2n=46。属成纤维细胞。培养基用加小牛血清。同工酶G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶

)B型。有限寿命42～46代。增殖速度较W1-38快，对不良环境敏感性较W1-38低。对人的病毒敏感。用于生产疫苗。

CHO-K1：从中国地鼠卵巢中分离的上皮样细胞。核型：2n=20～22。培养基：DEME培养基

0.1mmol/L次黄嘌呤，0.1mmol/L胸苷，

10%小牛血清，加入脯氨酸。

BHK-21:从5只无性别的生长1天的地鼠幼鼠肾脏中分离的;成纤维样细胞,核型为2n=44;培养基为DMEM加7%胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞构建。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞构建。

Vero：从正常成年非洲绿猴肾脏分离的。为贴壁依赖的成纤维细胞，核型2n=60；培养基为199培养基，加5%胎牛血清；用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、狂犬病毒。

Namalwa：从肯尼亚患有淋巴瘤病人获取，建成的人的类淋巴母细胞。2.8%的高倍体率，12～14条标记染色体。单条X，无Y。培养基为RPMI1640，添加7%胎牛血清。用于生产

α干扰素。

SP2/0-Ag14：通过融合的方法，从有羊抗红细胞活性的BALB/c

小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系P3X63Ag8融合杂交瘤SP2/NL-Ag

亚克隆中分离获得，

能耐受8氮鸟嘌呤20μg/ml但在含HAT选择培养基中不能存活。通常用培养基为DMEM，添加10%胎牛血清。用于生产单抗杂交瘤细胞和抗体。

Sf-91983年从亲代IPLB—SF21AE

中克隆形成。亲代细胞从秋粘虫的蛹卵组织中分离获得。它对苜宿尺蠖核型多角体病毒和其它杆状病毒高度敏感。通常用的培养基为Grace培养基，添加3.3g/L水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液,10%胎牛血清。用于高效表达外来蛋白制品。四、基因工程细胞构建和

筛选在生产中采用更多的更有前景的是融合细胞及采用基因工程构建的各种工程细胞。被用构建工程细胞的动物细胞有：

CHO-dhfr

、BHK-21、Namalwa、Vero、SP2/0、Sf-9等细胞。⒈真核细胞基因表达载体的构建使用的载体有两类：㈠病毒载体牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、杆状病毒㈡质粒载体

牛痘病毒：用构建多价疫苗腺病毒、逆转录病毒：用于基因治疗。杆状病毒：用于外源基因表达。

其作为载体的优点：

①双链DNA，易重组

②插入7～8kbDNA不影响正常病毒粒子的形成。③多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子；

④多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的20%～30%；⑤用光学显微镜可看到多角体，可以此作为标记物，选阳性克隆。⑥如用家蚕杆状病毒，还可在蚕体表达外源基因。

质粒载体在细菌和哺乳动物细胞体内都能扩增。都含有如下基本成分：①允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。②含有使基因表达的调控元件。

③能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。

④有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。⒉基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选基因载体导动物细胞常用方法是：磷酸钙沉淀法电穿孔法

HATHAT次黄嘌呤（H）核苷酸前体，使cell通过替代途径合成DNA氨基蝶呤（A）叶酸拮抗物，阻断cell合成DNA的主要途径胸腺嘧啶核苷（T）使cell通过替代途径合成DNA

cell合成DNA有两种途径：a)主要途径：糖、aa、合成核苷酸,合成DNA,需叶酸参与氨基蝶呤（A）可阻断b)替代途径：次黄嘌呤（H）、胸腺嘧啶核苷（T）HGPRT(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶);TK催化

磷酸钙沉淀法：溶解的DNA加Na2HPO4和CaCl2形成磷酸钙沉淀，DNA被包在磷酸钙沉淀中，形成DNA—磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触时，则通过细胞吞噬作用而将DNA导入。

电穿孔法：

借助电穿孔仪的高压脉冲电场，使细胞膜出现瞬时可逆性小孔，外源DNA沿小孔进入细胞。转化率较高，拷贝数低。五、细胞库的建立生产用的工程细胞必须建立两个细胞库：

⒈原始细胞库

⒉生产用细胞库⒈原始细胞库贮存时须有该细胞的详细挡案，包括：

①该细胞系的历史②该细胞系的特性③对各种有害因子的检查结果⒉生产用细胞库从原始细胞库来的，或从单一安瓶来，或从多个安瓶来即刻混合，经培养扩增再分装储存形成细胞库。需建挡案，进行无菌性无细胞交叉污染的检查。需确定最高使用的传代数。第四节动物细胞的培养

条件和培养基细胞体外培养基本条件:①无菌②营养充足,防止有害物质③氧气④随时清除代谢有害物质⑤良好的生存外环境⑥及时分种一、动物细胞的培养条件⒈器材的清洗和消毒⑴器材的清洗浸泡、刷洗、泡酸、冲洗⑵器材的消毒灭菌物理消毒化学消毒⒉水质:电阻值大于18MΩ,

去热原。⒊pH:7.2～7.4⒋渗透压:290～300mOsm/kg⒌温度:37±0.5C⒍空气:氧的饱和质60%,氧分压

4～0.7kPa二、动物细胞的培养

基的种类和组成分3类:⒈天然培养基⒉合成培养基⒊无血清培养基⒈天然培养基

血清、羊水、腹水等,成分复杂、成分不稳定⒉合成培养基

DME、MEM、DMEM、HAMF12、RPMI1640⑴氨基酸⑵维生素⑶糖类⑷无机盐⑸其它成分添加小牛血清：添加小牛血清的作用⑴提供生长因子和激素⑵提供贴附因子和伸展因子⑶提供结合蛋白⑷提供必需脂肪酸和微量元素⒊无血清培养基①提高重复性②减少微生物污染③供应充足稳定④产品易纯化⑤避免血清因素对细胞的毒性⑥减少血清中蛋白对生物测定的干扰无血清培养基加入添加剂⑴生长因子和激素⑵结合蛋白⑶贴附因子和伸展因子⑷有利细胞生长的因子和元素第五节动物细胞培养方

法和操作方式一、动物细胞大规模培养的方法依细胞种类:

原代培养、传代培养依培养基:

液体培养、固体培养依培养器和方式:

静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定床或流化床培养

从生产实际分为:

悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养⒈悬浮培养让细胞自由的悬浮于培养基内生长繁殖。⒉贴壁培养让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。⒊贴壁-悬浮培养⒊贴壁-悬浮培养⑴微载体培养⑵包埋和微囊培养⑶结团培养二、动物细胞培养的操作

方式⒈分批式操作⒉半连续式操作⒊灌流式操作第六节动物细胞生物反应

器及其检测控制系统一、动物细胞生物反应器的类型及其基本结构⒈搅拌式生物反应器⒉气升式生物反应器⒊中空纤维式生物反应器⒋透析袋或膜式生物反应器⒌固定床或流化床式生物反应器⒈搅拌式生物反应器⒉气升式生物反应器⒊中空纤维式生物反应器平床式中空纤维式生物反应器⒋透析袋或膜式生物反应器⒌固定床或流化床式生物反应器CellGenplus生物反应器二、动物细胞生物反应器的

检测控制系统⒈培养过程需检测的物化参数直接在线检出取样离线检测检测后计算

⒉主要参数的检测和控制方法⒉主要参数的检测和控制方法⑴温度⑵pH①在培养初期，控制进氧量②当细胞密度提高后控制

NaHCO3的量⑶溶氧⑷搅拌⑸进出液流量⑹其它第七节动物细胞制药的前

景与展望一、提高产量降低成本和改进质量方面的研究二、转基因动物的研究三、组织工程的研究一、提高产量、降低成本和改

进质量方面的研究

为了提高产量,要提高细胞表达水平。为降低成本，须改进培养基配方。为改进产品质量，关键是糖基化质量。改进工艺，生产设备等二、转基因动物的研究自1982年Palimiter提出用转基因动物来生产药用蛋白以来，发展迅速。优点：产量高成本低质量与天然一样。现还有不成熟之处。对动物和人的健康的影响。三、组织工程的研究组织工程：通过对大量细胞的培养，并用细胞直接作为一种治疗手段用于临床，或用培养的细胞进一步加工构成一种组织，如人造皮肤、人造肝脏、人造胰腺、人造血管、人造骨等并用于临床治疗。三、重组蛋白质在哺乳动物细胞中的表达

1．选择哺乳动物细胞表达体系的优点2．两个主要的哺乳动物细胞表达系统1．哺乳动物细胞表达体系的优点哺乳动物细胞表达体系的种类和数目已经发展很快。哺乳动物细胞表达体系有很多其他体系不能与之相比的优势。它具有复杂的翻译后加工系统，糖基化以及二硫键在合成和分泌过程中自然而然的正确形成。哺乳动物细胞具有产生正确折叠和完全生物活性的蛋白质。实例：组织血纤维蛋白溶酶原激活因子(tPA)、红细胞生成素(EPO)、人DNA酶。在大肠杆菌中表达tPA时，产生错折叠和非糖基化，而在酵母中表达tPA产生过糖基化，二者的产物都没有生物活性。分泌型哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统可以通过设计，使外源重组蛋白直接分泌到培养基中。这个重组表达单位包括N末端的信号肽，其作用是起始新生肽链插入到内织网中，此信号肽在分泌过程中被切除，从而产生具正确N端的重组蛋白质。从内织网到高尔基体再到细胞外空间的分泌过程产生糖基化和防止蛋白被胞内蛋白酶水解。分泌过程也使蛋白质二硫键正确配对和正确折叠。哺乳类动物细胞表达体系的另一个用处是在天然环境条件下，研究工程化基因产物的性质。如将胰岛素受体基因经突变后，再导入到特定细胞中表达发现，在受体蛋白质上单一氨基酸的突变可导致其对胰岛素结合活性的丧失，并导致激活自磷酸化和酪氨酸激酶。

2．两个主要的哺乳动物细胞表达系统在哺乳动物细胞中有两个基因表达系统可供选择，一是瞬时表达系统，一是稳定表达系统。瞬时基因表达系统是一个简单、有效的外源蛋白表达手段，其表达水平最高可以达到稳定细胞表达水平。蛋白质是由未整合的、不复制的质粒DNA产生的，这样使得蛋白质表达的时间相对短，只有48h到7天。稳定表达系统需要得到稳定转化的细胞株，需要1～2个月的时间，在稳定转化的细胞中，DNA被整合到染色体中，这使得重组蛋白质产物可以一代接一代地产生。四、噬菌体显示(Phagedisplay)对EPO分子片段的筛选关于噬菌体显示的表达载体噬菌体显示技术的操作EPO-EPOREMP-EBP

GeorgeP.SmithValeryA.PetrenkoGeorgeP.Smithb.in1941.Bsc.degreeinbiologyin1963,aPh.D.inbacteriologyandimmunologyfromHarvardUniversityin1970.AfterapostdoctoralfellowshipwithOliverSmithiesattheUniversityofWisconsin,hejoinedthefacultyoftheDivisionofBiologicalSciencesattheUniversityofMissouriinColumbiain1975asAssistantProfessorandsincehasbeenpromotedtoAssociateandFullProfessor.Hehaspublished35papersinareasincludingantibodystructureandevolution,theevolutionofrepeatedDNAsequences,genomics,andthebiologyofthefilamentousphage.Itisfromhisinterestinthefilamentousphagethattheideaofphagedisplayevolved.ValeryA.Petrenkob.In1949,haspublishedover70papersandhas13inventionsandpatents.OverviewThepast10yearshasseenremarkableprogressinourunderstandingofthereplicationcycleoftheM13phageThelifecycleisverysophisticatedInitialinfectiontransfersgeneticmaterialintohostwithlittlemembranedisruption.LateinfectionstagesperturbhostmembraneforreleaseofvirionsM13isnon-lyticM13StructureDimensions:6.5nmindiameterLengthdependantongenomebutwildtypeapproximately930nmMass16.3MDofwhich87%comprisedofproteinGenome:SinglestrandedcircularDNAmolecule,covalentlyclosedHousedinaflexibleproteincylinderM13StructureGenomeorientation78NucleotidehairpinregioncalledthepackagingsignallocatedatpVII/pIXterminusM13StructureProteinsLengthofphagecylindercomprises2700copiesofthe50-amino-acidmajorcoatproteinpVIIIAtoneterminus:5copiesof33AAresiduepVII5copiesof32AAresiduepIXAtoneterminus:5copiesof406AAresiduepIII5copiesof112AAresiduepVIM13GeneFunctionsGeneFunctionAminoAcidsMolWtIIDNAReplication41046137XDNAReplication11112672VBindingssDNA879682VIIIMajorcapsidprotein505235IIIMinorcapsidprotein40642522VIMinorcapsidprotein11212342VIIMinorcapsidprotein333599IXMinorcapsidprotein323650IAssembly34839502IVAssembly40543476XIAssembly10812424PhageLifeCycleInfectionprocessMultistepRequiresbacterialFconjugativepilusandbacterialTolQ,R&Acytoplasmicmembraneproteins.InitiatedbybindingofFpilustophagepIIIN2domain.Pilusretracts(triggeredbyphage???)bringingpIIIterminustotheperiplasm.N2bindingreleasesN1forinteractionwithbacterialTolAPhageFPilusOMCMTolQTolATolRPeriplasmN1N2PhageLifeCycleInfectionprocesscontSubsequentstepsunclearpVIII,pVII&pIXdisassembleintocytoplasmicmembraneasphageDNAistranslocatedintocytoplasm?OnceinthemembranepVIIIjoinspoolofnewlysynthesisedpVIIIfornewparticleformation.PhageLifeCycleReplicationComplementary(-)DNAstrandtoviral(+)DNAsynthesisedbybacterialenzymesGyrase,atopoisomerase,catalysesformationofdsDNA

supercoilscalledthereplicativeform(RF)The(-)strandoftheRFistranscribedandtranslatedintothephageproteinsThepIIproteinnicksthe(+)strandRFintheintergenicregiontoproduceaprimerforsynthesisofanewviralstrandpIIcircularisesthedisplaced(+)strandandconvertsittoasupercoiled

dsDNA;apoolofprogenydsDNAisthusformedAtacriticalconcentrationofpV,dimersofpVbindtothedsDNApreventingfurtherdsDNAproductionbutallowingsynthesisof(+)DNAPhageLifeCycleReplicationpV

dimersbindtothe(+)strandandwrapsitupA78nucleotidehairpinregionoftheDNAremainspVfreeandactsasapackagingsignalinitiatingthephageassemblyreactionpXisalsocytoplasmicallylocatedandisrequiredforreplicationbutitsroleisunclearAlloftheotherphageproteinsaresynthesisedandinsertedintothebacterialmembranePhageLifeCycleAssemblyOccursatbacterialadhesionzonelikesitespV

dimersareremovedandthecapsidproteinsareassembledaroundtheDNAasitisextruded.TheprocessisinitiatedbyinteractionofpVII,pIXandpVIIIwiththeDNApackagingsignalUnknownhowpVIandpIIIareaddedatendofvirionPhageReplicationSchematicDNAReplicationProteinsCapsid&Assembly

Proteins(+)+++/-pVPhageAssemblySiteFPilusPhageDNAPhageDisplayLibrariesPhagedisplayisapowerfultoolthatextendstherangeofmoderncombinatorialscreeningtechniques,allowingthediscoveryandcharacterisationofproteinsthatinteractwithadesiredtarget.Phagedisplayisasysteminwhichaproteinisdisplayedonthesurfaceofaphageasafusionwithoneofthecoatproteinsofthevirus.TheDNAthatencodesthisproteinishousedwithinthevirion.BycloninglargenumbersofDNAsequencesintothephage,displaylibrariesareproducedwitharepertoireofmanybillionsofuniquedisplayedproteins.PhageDisplayLibrariesUsingaprocessofbiopanning,onecanrescuephagethatdisplayaproteinthatspecificallybindstoatargetofinterest.Briefly,asimplemethodforbiopanninginvolvescoatingaplatewiththetargetandincubatingthelibraryontheplatetoallowphagedisplayingacomplementaryproteintothetargettobind.Non-bindingphagearethenwashedawayandthosethatareboundareeluted.Infectionofbacteriawiththebindingphageresultsinphageamplification.Successiveroundsofbiopanningenrichthepoolofphage,withclonesthatspecificallybindthetarget.PeptidePhageDisplaypVIIIPeptideDisplayDisplayoneverycopyofpVIIIlimitedto6-8aminoacidsbutarepotentiallyimmunogenicandsusceptibletoproteasesHybridvirionsinwhich80%ofpVIIIarewild-typeallowlargepeptidesandproteinstobedisplayedpIIIPeptideDisplayOnlyfivemoleculescanbedisplayedperphageLargeinsertspackagewellbutreduceinfectivityOvercomebydisplayingpeptideononlyonepIIImolecule=phagemidsystem;pIIIwildtypeencodedbyhelperphage,displayedpeptideencodedbyphagemidPhagedisplaymethod(1)M13(afilamentousphagecontainingss-DNAencasedinaproteincoat):containsfivecoatproteins,twoofwhicharegVIIIp(geneVIIIprotein)andgIIIp(geneIIIprotein).Phagedisplaymethod(2)Phagedisplaymethod(2):(contd.)Phagedisplaymethod(2):(contd.)PhagedisplayofrandompeptidelibrariesidentifiedagonsitsoferythropoietinreceptorAgonists:whichmimicthefunctionofahormonebybindingtoitsreceptorandcausingthenormalresponse.Antagonists:whichbindtothereceptorbutdonotactivatehormone-inducedeffectsPhagedisplayofrandompeptidelibrariesidentifiedagonsitsoferythropoietinreceptor(contd.)Toidentifypeptidesorsmallmoleculeswhicheitherinhibitorstimulatehormonefunction.Thehot-spotprinciple:asmallnumberofresiduesatabindinginterfacecontributemostofthebindingenergy.Erythropoietin(EPO):acytokinehormonewhichstimulatesformationofredbloodcells.EPOR:erythropoietinreceptorEBP:extra-cellulardomainofEPORPhagedisplayofrandompeptidelibrariesidentifiedagonsitsoferythropoietinreceptor(contd.)