第七章分子发光分析法(荧光、磷光和化学发光)

第七章

分子发光分析法molecular

luminescence

analysis

第一节分子荧光与磷光molecularfluorescenceandphosphorescence第二节分子荧光与磷光分析法molecularfluorescenceandphosphorescenceanalysis第三节化学发光分析法chemiluminescence

analysis2023/2/31一、分子荧光与磷光产生过程luminescenceprocessofmolecularfluorescencephosphorescence二、激发光谱与荧光光谱excitationspectrumandfluore-scencespectrum三、荧光的产生与分子结构关系

relationbetween

fluorescenceandmolecularstructure四、影响荧光强度的因素factorinfluenced

fluorescence第一节

分子荧光与磷光molecularfluorescenceandphosphorescence2023/2/32一、荧光与磷光的产生过程

luminescenceprocessofmolecularfluorescenceandphosphorescence由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。1.分子能级与跃迁分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；

基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、…电子激发单重态S1、S2…

；第一、第二、…电子激发三重态T1、T2…

；2023/2/332.电子激发态的多重度

电子激发态的多重度：M=2S+1，S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；例如，钠只有一个外层电子，S=1/2，因此M=2(1/2)+1=2，所以将产生双重线；若为碱土金属，有两个外层电子，它们可能同一个方向自旋，则S=1/2+1/2=1，M=3，为三重线，或者向相反方向自旋，S=1/2-1/2=0，M=1，为单重线。平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；通常用S和T分别表示单重态和三重态。S0→T1

禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小；

2023/2/342.激发态→基态的能量传递途径

电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛豫无辐射跃迁

激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-7～10-9

s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；2023/2/35S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫2023/2/36非辐射能量传递过程振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12

s。

内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。2023/2/37辐射能量传递过程荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为S1→S0跃迁），发射波长为‘2的荧光；10-7～10-9

s。

由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；‘2>2>1；磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（T1→S0跃迁）；电子由S0进入T1的可能过程：（S0→T1禁阻跃迁）

S0→激发→振动弛豫→内转换→系间跨越→振动弛豫→T1发光速度很慢：10-4～100s。

光照停止后，可持续一段时间。2023/2/38二、激发光谱与荧光(磷光)光谱

excitationspectrumandfluore-scencespectrum荧光(磷光)：光致发光，必须选择合适的激发光波长，激发光波长如何选择？1.荧光(磷光)的激发光谱曲线由于分子对光的选择性吸收，不同波长的入射光具有不同的激发效率。如果固定荧光（或磷光）的发射波长（即测量波长)而不断改变激发光（即入射光）的波长,并记录相应的荧光（或磷光）强度，所得到的发光强度对激发波长的谱图称为荧光（或磷光）的激发光谱（图中曲线I）。如果固定激发光的波长和强度而不断改变荧光（或磷光）的测量波长（即发射波长），并记录相应的荧光（或磷光）的强度，所得到的发光强度对发射波长的谱图则为荧光（或磷光）的发射光谱。2023/2/392.荧光光谱(或磷光光谱)固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。激发光谱和发射光谱可作为发光物质的鉴别手段，并可用于定量测定时作为选择合适的激发波长和测量波长的依据。2023/2/310应该指出，激发光谱曲线与其吸收曲线可能相同，但前者是荧光强度与波长的关系曲线，后者则是吸光度与波长的关系曲线，两者在性质上是不相同的。当然激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子数目最多，这可说明所吸收的光能量也是最多的，自然能产生最强的荧光。2023/2/311200260320380440500560620荧光激发光谱荧光发射光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱2023/2/3123.激发光谱与发射光谱的关系

a.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。

b.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图2,1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如‘2)。

c.

镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。2023/2/313镜像规则的解释

基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。

2023/2/314应用镜像对称规则，可以帮助判别某个吸收带究竟是属于第一吸收带中的另一振动带，还是更高电子态的吸收带。根据镜像对称规则，如不是吸收光谱镜像对称的荧光峰出现，表示有散射光或杂质荧光存在。诚然，也存在少数偏离镜像对称规则的现象，究其原因，或是由于激发态时核的几何构型与基态时不同，或是由于在激发态时发生了质子转移反应或形成激发态二聚体（或激发态复合物）等原因而引起的。2023/2/315200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱2023/2/316三、荧光的产生与分子结构的关系

relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（）：荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。2023/2/3172.化合物的结构与荧光（1）跃迁类型：→*的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强，如-OH、-NH2、-OCH3、-NR2等；吸电子基团如-NO2、-COOH等减弱荧光，程度高时，无荧光。2023/2/3182023/2/319（5）取代基的空间障碍对荧光也有影响（一般空间阻碍导致荧光减弱），立体异构现象对荧光强度有显著的影响（一般反式荧光强，顺式弱或无荧光）。（6）金属螯合物的荧光除过渡元素的顺磁性原子会发生线状荧光光谱外，大多数无机盐类金属离子，在溶液中只能发生无辐射跃迁，因而不能产生荧光。但是，在某些情况下，金属螯合物却能产生很强的荧光，并可用于痕量金属离子的测定，主要是由于螯合物中配位体的发光。一般来说，能产生这类荧光的金属离子具有硬酸型结构，如Be、Mg、Al、Zr、Th等。2023/2/320四、影响荧光强度的因素

factorsaffectingfluorescenceintensity

影响荧光强度的外部因素1.溶剂的影响除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化（极性大，荧光强）；2.温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。3.溶液pH

对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；2023/2/3214.内滤光作用和自吸现象自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；2023/2/3225.溶液荧光的猝灭碰撞猝灭，是荧光熄灭的主要原因。它是指处于单重激发态的荧光分子与熄灭剂发生碰撞后，使激发态分子以无辐射跃迁方式回到基态，因而产生熄灭作用。荧光熄灭的程度主要取决于荧光分子与熄灭剂的反应速度和熄灭剂的浓度，另外碰撞猝灭还与溶液的黏度有关，黏度大、熄灭作用小，碰撞熄灭随温度的升高而增加。能量转移使荧光猝灭。氧的熄灭作用，溶液中的溶解氧常对荧光产生熄灭作用。这可能是由于顺磁性的氧分子与处于单重激发态的荧光物质分子相作用，促进形成顺磁性的三重态荧光分子，即加速系间跨越所致。2023/2/323一、仪器与结构流程instrumentandgeneralprocess

二、荧光分析法和应用fluorescenceanalysisandapplication三、磷光分析法的应用phosphorescenceanalysisandapplication第二节

分子荧光与磷光分析法molecularfluorescenceandphosphorescenceanalysis

2023/2/324一、仪器结构流程测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。基本流程如图：单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；光源：氙灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区)检测器：光电倍增管。2023/2/325仪

器

光

路

图2023/2/326仪器框图该型仪器可进行荧光、磷光和发光分析；2023/2/327同步扫描技术根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差()和固定能量差及可变波长三种；同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率；如图。合适的可减少光谱重叠；酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发射光谱严重重叠，但<15nm的同步光谱只显示酪氨酸特征光谱；>60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。2023/2/328可获得三维光谱图的仪器可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图2023/2/329磷光检测荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。测量方法：（1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。（2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。室温测量时，不需要杜瓦瓶（英国化学家、物理学家杜瓦发明的瓶子）。2023/2/330二、荧光分析方法与应用1.特点（1）灵敏度高比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？（光度法，检测大信号的微小差别，荧光法小背景下的荧光强度）检测下限：0.1～0.1g/cm-3相对灵敏度：0.05mol/L奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。（2）选择性强既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3）试样量少缺点：应用范围小。为什么？2023/2/3312.定量依据与方法(1)定量依据荧光强度

If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率：

If=Ia由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-lc)If=I0(1-10-lc)=I0(1-e-2.3lc)浓度很低时，将括号项近似处理后：

If

=2.3I0lc

=Kc2023/2/332（2）定量方法标准曲线法：

配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度。比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较。2023/2/333例、还原态的NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型或辅酶I还原型）是一种具有高荧光的重要的辅酵素。它在340nm有最大吸收，在465nm有最大发射。由标准NADH溶液得到下列荧光强度数据：浓度NADH,μM相对强度浓度NADH,μM相对强度0.10013.00.50059.70.20024.60.60071.20.30037.90.70083.50.40049.00.80095.12023/2/334请建立一个校正曲线，并用以估计某未知溶液中的NADH浓度，此溶液的荧光相对强度为42.3。解：以荧光相对强度为纵坐标，以NADH之浓度为横坐标，标出以上八个数据点，以直线相连，即可得到校正曲线如下：2023/2/335相对荧光强度NADH浓度/μM2023/2/336该曲线的回归方程为：Y=1.76071+116.64286X(r=0.99978)将未知溶液的相对强度标于校正曲线上，可得其对应浓度为0.34μM。或代入回归方程：2023/2/3373.荧光分析法的应用(1)无机化合物的分析与有机试剂形成配合物后测量；可测量约60多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)生物与有机化合物的分析见表2023/2/3382023/2/3392023/2/340三、磷光分析法的应用1.稠环芳烃分析采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）；见表2.农药、生物碱、植物生长激素的分析烟碱、降烟碱、新烟碱、2，4-D（一种植物生长激素）、萘乙酸等分析检测限0.01g/cm-3

3.药物分析和临床分析见表2023/2/3412023/2/342重原子效应：I、Br、Pb等称为重原子。在重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，因此容易发生自旋轨道的相互作用，增加由单重态转化为三重态的速度，即加快了系间跨越的速度。这就是卤素取代基随原子序数增加而荧光下降的原因。不难理解，由于重原子效应增加系间跨越的速度，使荧光减弱，磷光则相应增强。2023/2/3432023/2/344一、基本原理principle

二、化学发光分析的特点characteristics三装置与技术instrumentandtechnology第三节

化学发光分析法chemiluminescence

analysis2023/2/345一、基本原理principle1.化学发光反应化学发光不是由光、热、电能所产生的光辐射。在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。

A+B=C+D*D*→D+h（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当E

=

170～300kJ/mol；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行；化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。2023/2/3462.化学发光效率激发态产物分子的化学效率：激发态分子的发光效率：时刻t的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：dc/dt分析物参加反应的速率；2023/2/3473.化学发光强度与化学发光分析的依据在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，对于一级动力学反应：

dc/dt=Kc；K为反应速率常数。定量依据：（1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性：2023/2/3484.化学发光反应的类型（1）气相化学发光反应a.一氧化氮与O3的发光反应

NO+O3→NO2*NO2*→NO2+h发射的光谱范围：600～875nm，灵敏度1ng/cm-3；b.氧原子与SO2、NO、CO的发光反应

O3

→O2+O（1000C石英管中进行）

SO2+O+O→SO2*+O2

SO2*→SO2+h最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3；2023/2/349

O3

→O2+O（1000C石英管中进行）

NO+O→NO2*

NO2*→NO2+h发射光谱范围：400～1400nm；灵敏度1ng/cm-3；氧原子与CO的发光反应：

CO+O→CO2*

CO2*→CO2+h发射光谱范围：300～500nm；灵敏度1ng/cm-3；氧原子与NO的发光反应：2023/2/350c.乙烯与O3的发光反应

乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：

CH2O*→CH2O+h最大发射波长：435nm；对O3的特效反应；线性响应范围1ng/cm-3～1g/cm-3；2023/2/351（2）火焰中的化学发光反应在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；a.一氧化氮NO+H→HNO*

HNO

*→HNO+h发射光谱范围：660～770nm；

最大发射波长：690nm；

在富氢火焰中：

NO2+2H→NO+H2O该反应十分迅速；可用于测定空气中NOx的总量。2023/2/352b.硫化物挥发性硫化物SO2、H2S、CH3SH、CH3SCH3等在富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：SO2+2H2→S+2H2OS+S→2S2*

S2*→S2+h发射光谱范围：350～460nm；

最大发射波长：394nm；灵敏度：0.2ng/cm-3；发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。2023/2/353（3）液相中的化学发光反应机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；化学发光反应效率：0.15～0.05；鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应,使发出的光大大增强；利用这一现象可测定这些金属离子。如Co(II)、Cu(II)、Ni(II)、Au(III)、Os(III、IV、V)等。2023/2/3545.化学与生物发光分析的应用（1）鲁米诺发光。该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等（2）可检测低至10-9mol/L的H2O2；（3）间接测定某些生物试样

氨基酸+O2

酮酸+NH3+H2O2氨基酸氧化酶葡萄糖+O2+H2O葡萄糖酸+H2O2通过测定生成的H2O2，确定氨基酸、葡萄糖含量。葡萄糖氧化酶2023/2/355

草酸二酯(能量提供体)+高浓度双氧