第二周PCR检测技术及应用

PCR检测技术及其应用现代生物学检测技术什么是PCR技术？PCR(polymerasechainreaction),即聚合酶链反应。它是体外模拟DNA复制的过程，以单链DNA为模板，以人工设计的寡核苷酸为引物，利用稳定的聚合酶，掺入单核苷酸来特异地扩增DNA片段的技术。什么是PCR技术？反应特点：特异性强；灵敏度高；简便、快速；对标本的纯度要求低DNA复制过程简述请课前准备的同学进行讲解。PCR反应原理PCR检测分三个步骤：1是PCR扩增模板的制备，也就是病原微生物基因

组提取2是PCR扩增，即目的基因特异扩增过程（最重要的步骤）3是琼脂糖凝胶电泳分析，在紫外灯下检测基因片

段重点步骤：PCR扩增期（观看动画）PCR扩增期包括变性－退火－延伸三个基本反应步骤：模板DNA的变性：加热至94-96℃，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA离解成为单链；模板DNA与引物的退火（复性）：温度降至50-65℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，合成一条与模板DNA链互补的半保留复制链。

72℃

重复变性－退火－延伸三个过程，目的基因被扩增放大几百万倍。每个循环需2-4min，整个PCR反应需要2-3h。问题思考：聚合酶在催化引物延伸的反应中在下一循环的加热变性中会失活，导致循环都要加一次酶？怎么解决？

1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。而后，Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高，叫做TaqDNA聚合酶。PCR的实验室检测观看操作视频检测过程：设计引物---扩增---检测PCR的检测过程PCR扩增体系主要包括：引物 PCR反应介导物DNA模板

被扩增目的物耐热DNA聚合酶 PCR反应催化剂dNTPs 反应底物缓冲液

提供反应环境镁离子

耐热DNA聚合酶活性依赖离子PCR产物的检测1、凝胶电泳：EB（溴化乙锭）可镶嵌在DNA片段中，并在一定波长的紫外线下发射出橘红色的可见光。在凝胶介质中不同大小的PCR片段在一定电压下的迁移率不同，从而在凝胶中呈现出不同的亮线。缺点：只能对终产物进行分析，无法对起始模版准确定量；必须在扩增反映结束后借助电泳方法分析，费时费事；无法对扩增反应实时检测；EB有毒Marker是人为的把一系列已知大小的DNA（或已知质量的蛋白，当然PCR中用的是DNAmarker不是蛋白marker）混合在一起，在电泳的时候对照用。PCR产物的检测2、荧光PCR：反应体系中在PCR过程中利用荧光染料在光刺激的情况下释放的荧光能量的变化直接反映出PCR扩增产物量的变化。优点：无需PCR后电泳处理，仪器在线实时检测，避免人为判断，利用自动化和联网管理。观看荧光PCR检测视频PCR分类1、多重PCR技术（P170）常规一对引物扩增，只产生一个特异的DNA片段。若有十分庞大的基因序列需要检测，超过了PCR扩增DNA片段的长度，则采用常规PCR就需要分段进行多次扩增，费时费力。常用于转基因食品检测。PCR分类2、实时荧光定量PCR技术（P171）视频在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。与普通PCR的区别普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。PCR检测所需要的仪器设备（1）、PCR实验室

PCR只需几个DNA分子作模板就可大量扩增，应注意防止反应体系被痕量DNA模板污染和交叉污染，这也是最容易造成假阳性原因之一。实验室布局应重点考虑避免这种污染。因此用于PCR检测的实验室要进行功能区域划分，从对环境要求的严格程度和功能上可将PCR整个实验流程划分为四个区域：1.配液区（准备区）2.模板提取区3.PCR扩增区4.电泳区（二）实验器材必须使用PCR专用吸头试剂盒的运输和贮存PCR试剂盒在适当的贮存温度下的有效期一般为6个月核酸扩增部分的试剂一般要贮存于-20℃产物检测部分试剂则贮存于2～8℃。电泳槽、电泳仪的图片凝胶成像系统的图片观看视频，回忆PCR实验室检测步骤1是PCR扩增模板的制备，也就是病原微生物基因组提取2是PCR扩增，即目的基因特异扩增过程3是琼脂糖凝胶电泳分析，在紫外灯下检测基因片段PCR检验技术在食品工业中的应用一、在食品致病微生物检测中的应用（P173）检测沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌、链球菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌等。二、在食品转基因成分检测中的应用（补充）抗虫害、抗病毒、抗杂草的转基因玉米、黄豆、油菜、土豆、西葫芦等。李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)（P173）对牛奶等食品均有不同程度的污染,是食品中的主要病原菌。传统的检测方法存在周期长、操作繁琐等不足之处。在食品致病微生物检测中的应用（P173）PCR法：1）提取总DNA；2）根据LM的保守序列设计引物特异地PCR扩增。优点：对其它菌不产生反应，显示了较强的特异性；

检测的敏感性非常高；检测只需要5～6h,较之传统方法快得多。通过对TaqDNA聚合酶和引物浓度等条件的优化，建立简便实用的快速检测牛奶中LM菌的试剂盒，具有良好的应用前景。在食品转基因成分检测中的应用转基因食品（geneticallymodifiedfoods,GMF)是由细胞DNA中经非生殖方法插入了特定外源基因或基因片段，并获得某种良好性状的动物