生物技术制药-第七章 发酵工程技术

第二章

发酵工程制药

第一节概述一、发酵工程 微生物工程:利用微生物制造工业原料与工业产品并提供技术服务的技术。涉及到生命体的繁殖、生长、生产、衰老等过程，实质上是一个非常复杂的自催化过程。发酵工程是生物技术的基础，其他技术如基因工程、细胞工程、酶工程等都与发酵工程密切相关。发酵中的化学反应是通过微生物完整细胞的综合生物化学过程实现，在发酵工业中，要求微生物细胞既能正常生长，又能过量积累目的产物。现代的发酵工业已形成完整的体系，包括抗生素、氨基酸、维生素、有机酸、多糖、酶制剂、单细胞蛋白、基因工程药物、核算类物质及其他生物活性物质的生产。(一)发酵的定义1、传统发酵

最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。2、生化和生理学意义的发酵指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。3、工业上的发酵

泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程,包括：1.厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。2.通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等。产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。(二)发酵工业定义：是指利用生物的生命活动产生的酶，无机或有机原料进行酶加工，获得产品的工业。发酵食品有机酸氨基酸核酸类物质酶制剂医药工业（抗生素…）饲料工业（单细胞蛋白环境工程（废物处理）其它（冶金工业…）抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、生物农药、生物肥料等(1)传统生物技术(2)现代生物技术基因工程菌发酵二、发酵类型

1、微生物菌体发酵定义：是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为目的的产品的发酵工业，包括单细胞的酵母和藻类、担子菌，生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防治疾病用的疫苗等。药用微生物制剂等。特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，生长速率最大时期也是产物合成速率最高阶段，生长稳定期产量最高。2、微生物的酶目前的酶多数来源于微生物发酵医用酶制剂的生产医药工业用酶酶的特点：易于工业化生产，便于改善工艺提高产量。生物合成特点：需要诱导作用，或遭受阻遏、抑制等调控作用的影响，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需给予注意。3、微生物代谢产物发酵包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代谢产物。对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的，称为初级代谢产物或中间代谢产物。各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或停止生长时期即稳定期所产生的，来自于中间代谢产物和初级代谢产物。1,3-丙二醇两步发酵法糖甘油1,3-丙二醇酵母伯氏肺炎杆菌、丁酸梭菌等4、微生物的生物转化定义：是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似但具有更多经济价值的化合物。最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应而形成的。三、微生物发酵生产药物的分类（一）抗生素类9000种微生物发酵占70％。有价值的抗生素，几乎全部由微生物生产抗细菌，病毒，真菌，肿瘤，原虫，寄生虫等（二）氨基酸类单个氨基酸制剂：复方氨基酸制剂：

微生物发酵法：酶转化法黄色短杆菌合成赖氨酸的途径（三）核苷酸类肌苷酸，肌苷，AMP，ATP，辅酶等（四）维生素类维生素C的原料药2-酮基-古龙酸，维生素A的前体B-类胡萝卜素，维生素D2的前体麦角甾醇，维生素B2，B12等（四）甾体类激素甾体类激素的生产过程中，一些特异反应需借助微生物的反应。（五）治疗酶及酶抑制剂药用酶酶抑制剂四、发酵工程制药特点及发展趋势（1）菌种是根本（2）理论产量存在“生物学变量”（3）常温常压下反应，安全，条件简单（4）纯种培养，防污染（5）可制备复杂高分子化合物（6）分子水平，定向发酵，组合生物合成等（7）发酵工业成本低菌种选育自然界选种、诱变育种、基因工程、细胞工程培养基配制根据培养基的配制原则制备，实践中需多次试验配方灭菌杀灭杂菌（胞体、孢子及芽孢）扩大培养和接种发酵过程（中心阶段）检测进程，满足营养需要；严格控制温度、pH、溶氧、转速等分离纯化菌体：过滤、沉淀；代谢产物：蒸馏、萃取、离子交换发酵工程基本流程发酵的基本过程发酵的基本过程:菌种种子制备发酵发酵液预处理提取精制菌种菌种的性能质量，包括菌种的生产能力、生长繁殖情况和代谢特性决定了发酵水平的高低。要求：产量高、生长快、性能稳定、容易培养。保藏：休眠状态保存在冷冻干燥管中，放于0~4度恒温冰箱内。临时取出接种后仍需冷藏。使用期：砂土管中为1~2年菌种应不断纯化，淘汰变异菌落，防止衰退。种子制备使菌种繁殖，以获得足够数量的菌体，以便接种到发酵罐中。发酵使微生物产生大量的目的产物，是发酵的关键阶段。产物提取发酵液是一种混合物，提取过程包括：①发酵液的预处理和过滤；②提取；③精制典型发酵过程发酵工程的发展现代意义上的发酵工程是一个由多学科交叉、融合而形成的技术性和应用性较强的开放性的学科。“农产手工加工——近代发酵工程——现代发酵工程”。发酵工程的发展第一阶段：利用传统的微生物发酵生产葡萄酒、酒、醋、酱、奶酪等食品。凭借经验、探索本质巴斯德为发酵工程提供了理论基础，被誉为生物工程之父。第二阶段：1900-1940，新的发酵产品不断出现，主要有酵母、甘油、乳酸、柠檬酸、丁醇和丙酮等。梭菌引起丙酮、丁醇发酵，服务于战争的弹药制造。丁醇的制备时第一个进行大规模工业生产的发酵过程，也是工业生产中首次采用大量纯培养技术的工艺，而这一个工艺成功的重要因素是：排除了培养体系中其他有害微生物，在该时期是相当先进的生物技术。第三阶段：发酵工业大发展时期，青霉素工业化成功地推动了发酵工业的发展。主要标志有：深层培养、生产大规模化，多种抗生素、氨基酸、核酸发酵成功，甾体的微生物转化等。该阶段采用纯种发酵，进行无菌操作，对操作条件有严格的控制，相应地采用较复杂的工艺和设备。1929年，Fleming发现青霉素，但当时无法提取精制。第二次世界大战促使实现了青霉素的工业化生产。1942年，以青霉素工业生产为标志深层通气培养法的建立标示了发酵工程发展的一次新飞跃。预示着发酵工程从厌氧发酵为主的工艺跃入深层通气发酵为主的工艺，该工艺的区别不仅仅是通气，更是与此相适应的一整套工程技术，如大量灭菌空气的制备、中间无菌取样技术、大罐无菌操作和管理技术、产品分离提纯技术、设备的设计技术等。1944年，第二个抗生素链霉素诞生第四阶段，基因工程等高新技术应用阶段。提出DNA双螺旋模型发现细胞中的“质粒”是能在细菌染色体外进行自我繁殖的细胞质因子（基因操作起点）DNA限制酶和连接酶的发现发酵工程的研究内容菌种的培养和选育、菌的代谢与调节、培养基灭菌、通气搅拌、发酵条件优化、发酵过程各种参数与动力学、发酵反应器的设计与自动控制、产品的分离纯化和精制发酵工业的生产水平取决于三个要素：生产菌种、发酵工艺和发酵设备。第二节、发酵工程中的微生物一、常见的药用微生物发酵工程所利用的微生物主要是细菌、放线菌，酵母菌和霉菌细菌放线菌（一）细菌主要生产氨基酸，核苷酸，维生素等（二）放线菌产抗生素最多的一类微生物另外生产B12,酶，甾体转化抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：放线菌（链霉素；四环素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源链霉菌（三）真菌抗生素维生素酶制剂有机酸等药用真菌（大型真菌）1.藻状菌纲：根霉；犁头霉2.子囊菌纲：酵母3.担子菌纲：牛肝菌，灵芝4.半知菌纲：曲霉；青霉；头孢酶二、生产菌种的选育工业化菌种的要求1.遗传性能要相对稳定2.生长速度快，不易感染它种微生物或噬菌体3.目标产物产量接近理论转化值4.目标产物分泌到胞外5.尽可能减少类似物产量6.能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物优良菌种是发酵工程产品开发的关键。自然界中分离的野生型菌种在产量和质量上都不能满足工业生产的要求，必须通过人工培育。优良菌种的选育不仅为发酵工业提供高产菌株，还可以提供各种类型的突变菌株。菌种选育的物质基础遗传物质支配着各种酶在生物体内有条不紊的行使其功能。DNA分子结构的改变时诱变育种的工作基础，染色体搭配的变化交换是杂交育种的根据。对DNA分子结构和它复制过程的了解江有利于充实诱变育种的理论根据你。质粒也是遗传物质，是染色体外的遗传结构，能在细胞中进行自主复制，并能离开染色体单独存在。许多质粒携带一些能影响宿主细胞类型的基因。菌种选育包括自然选育、诱变选育、杂交选育等经验育种方法，同时包括控制杂交育种、原生质体融合、基因工程等定向育种方法。自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。（1）自然选育利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程自然选育就是将正突变菌株挑选出来，进行扩大培养。该方法可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产水平、提高产物产量的目的，但是效率低、进展慢。1采样2.分离菌株自然选育操作步骤：一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。平板分离(注意形态的观察)发酵试验单细胞(孢子)悬液的制备挑选单菌落礼来公司花了10年的时间从40万株微生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。（2)自发突变与定向育种一定情况下，长期处理微生物并移种，累积自发突变体结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。筛选抗性株，可成为高产株抗性突变株的筛选直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业生产菌种选育突变、体内重组体外重组（基因工程）（3）诱变育种用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种微生物在生理和形态上的变化只要是可遗传的都称为变异。变异~~环境变化而出现的变化诱变机制三种类型：微小损伤突变、染色体畸变（大损伤突变）、染色体组突变。1、微小损伤突变碱基置换：ACC->GCC=>色氨酸UGG->精氨酸CGG，蛋白质发生改变码组移动突变：在DNA分子的某一位置缺失或插入一对或几对核苷酸碱基而使遗传密码移位。2、染色体畸变（大损伤突变）由遗传物质的缺失、重复或重排而造成的染色体异常突变。包括一条染色体内发生的畸变和非同源染色体之间发生的畸变易位：非同源染色体之间部分相连接的现象。倒位：染色体的某一部分以颠倒的顺序出现在原来位置上缺失：染色体上失去一个或多个基因遗传物质的节段重复：染色体上增加一段染色体片段，使同一染色体上某些基因重复出现。注意易位和倒位都使基因排列顺序改变，而基因数目不变。对染色体畸变而言，缺失是指足够长的DNA片段的缺失，而不是单个核苷酸的缺失（码组移动突变）。3、染色体组突变指由有丝分裂或减数分裂异常而产生的染色体数目或组数的变化。诱变剂诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂物理：紫外线，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍,5-Br-U{生物：噬菌体物理诱变剂：紫外线、X-射线、γ-射线，快中子；目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。化学诱变剂：金属离子、一般化学试剂、生物碱、抗代谢物、抗生素及高分子化合物、杀菌剂、染料、碱基类似物、5-氟尿嘧啶、烷化剂等。使用最多、最有效的是烷化剂。大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效根据化学诱变因素对DNA的作用形式可分为三类：与一个或多个核酸碱基起化学变化，引起DNA复制时碱基配对的转换而导致变异。亚硝酸、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯等与天然碱基十分接近的类似物掺入到DNA分子中而引起变异，如5-溴尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤等DNA分子上减少或增加一两个碱基引起碱基突变点以下全部遗传密码转录和翻译错误（码组移动突变），如吖啶类物质。诱变育种步骤出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养分离和筛选筛选的方法

随机筛选

形态

理性化筛选（4）杂交育种通过有性生殖进行(5)原生质体融合原生质体融合(protoplastfusion)：指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。意义：打破了微生物的种界界限，可实现远缘菌株的基因重组。可使遗传物质传递更为完整、获得更多基因重组的机会。可与其他育种方法相结合，如把常规诱变和原生质体诱变所获得的优良性状，组合到一个单株中。原生质体融合育种去除了细胞壁障碍，亲株基因组直接融合、交换、重组，在融合后两亲株的基因组之间有机会发生多次交换，产生各种各样的基因重组，得到多种类型的重组子，并可进行多级融合（即两个以上的亲株融合）。融合重组频率高，可用温度、药物或紫外线照射处理来纯化亲株一方或双方，然后再融合、再生、筛选重组子。该技术操作简便、重组频率高，是一种很有效的遗传育种手段，已用它来改良菌株，提高代谢产物的产量，而且能打破种属界限，产生重组子，并可能产生新化合物。去细胞壁融合筛选溶壁作用：不同菌株要求不同酶，细菌、放线菌可用溶菌酶；酵母用蜗牛酶；霉菌用纤维素酶和蜗牛酶融合：原生质球在高渗溶液中用PEG助融筛选：融合后在再生培养基上培养，筛选融合重组子。原生质体融合的一般程序菌龄：采用对数前期的菌体进行酶解，原生质体形成率高培养基：选用限制性培养基PEG：引起凝集，有利原生质体间的亲和外界因素：高渗溶液、再生培养基中加酵母膏促进再生影响融合的因素基因突变：自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化：点突变、易错PCR、同序法DNAShuffling等（6）基因重组进化育种错位PCR基本步骤(1)用DNaseI消化功能相同的一组基因片段(A)，从而产生随机小片段(B)。(2)经提纯后，用无引物(经变性后可互为引物)的类似PCR反应重新装配这些小片段成完整长度的重组基因片段(C)，在装记过程中被证明有低水平点突变产生。3)克隆并选择正突变体(D)，并将正突变体的重组基因片段作新一轮的体外重组。项目进化速度进化对象进化周期影响对象突变效率常规定向进化缓慢进化整个基因组多年完整基因组低DNAShuffling快速进化特定基因/操纵子/病毒几天部分基因组高DNAShuffling与常规定向进化的比较筛选合理的筛选方法和程序是菌种选育的重要问题，其中初步筛选是关键性的步骤。抗生素的育种中初筛一般选择随机筛选方法，从中选出产量最高者进一步复筛，该方法较为可靠，但工作量大，需进行大量筛选。为提高筛选效果，根据抗生素生物合成直接或间接有关的某些性状进行初步筛选，然后在合适条件下发酵并测定其生产抗生素的能力，即“理性化筛选”。从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛选而产生的这些特性，称为遗传标记。具有较大实用性的有三种1.自身耐药突变株2.结构类似物或前体类似物的耐受突变株3.营养缺陷及其回复突变株理性化筛选饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片变色圈指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，如待筛选菌具有该营养物的前体转化成营养物能力，工具菌就能围绕该菌生长待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质三、菌种保藏在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。斜面低温法：短期保存石蜡油封存法：中期保存沙土管：产孢子和芽孢的麸皮保存法：产孢子的霉菌和放线菌，工厂用甘油悬液法：基因工程菌冻干保藏：最广泛使用的方法。大部分菌种可以在冻干状态下保藏10年之久。且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输液氮法：最为有效，保藏15年以上，宿主保藏法：活细胞内寄生的微生物第三节、发酵设备及消毒灭菌一、发酵设备发酵罐是发酵工程中最重要的设备之一

一个优良的培养装置应具有：严密的结构良好的液体混合性能高的传质和传热速率灵敏的检测和控制仪表1、搅拌釜式反应器：目前使用

最广泛的发酵反应器机械搅拌发酵罐1）适宜的径高比，罐身较长，氧利用率较高2）能耐受一定的压力3）搅拌通风装置4）足够的冷却面积5）罐内要减少死角6）搅拌器的轴封要严密，以减少泄露罐体：培养微生物的巨大容器，密闭式的，在发酵过程中要保持一定的罐压，通常灭菌的压力约为2.5×105

Pa形状，圆柱形，两端椭圆形,受力均匀，减少死角，物料容易排除，高度与直径比1.7-4：1，有力空气利用率搅拌器档板克服搅拌器运转时液体产生的涡流，将径向流动改变为轴向流动，促使液体激烈翻动，增加溶氧速率消泡器锯齿式、梳状式及孔板式装于搅拌轴上，齿面略高于液面直径罐径的0.8~0.9罐体表面各种装置：

中大型发酵罐装有供维修、清洗的入孔罐顶装有窥镜和孔灯，在其内面装有压缩空气或蒸汽吹管罐顶接管：进料管、补料管、排气管、接种管、压力表接管罐身接管：冷却水进出管、空气进管、温度计管和测控仪器接口（二）发酵辅助设备无菌空气系统：过滤除菌（使用活性炭，石棉滤板，多孔合成树脂等）灭菌系统发酵车间的管道阀门等发酵对无菌空气的要求是：无菌，无灰尘，无杂质，无水，无油，正压等几项指标；发酵对无菌空气的无菌程度要求是：只要在发酵过程中不因无菌空气染菌，而造成损失即可。在工程设计中一般要求1000次使用周期中只允许有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为N=10-3

高空取气管是远离地面几十米的管子。地面附近空气中所含的微生物和灰尘等均比高空空气中含的多，每升高10米，空气中杂菌可降低一个数量级因此从高空取气要比从低空取气有利得多。

油水分离器其内部同时采用直接拦截，惯性碰撞，布朗扩散及凝聚等机理，能有效地去除空气中的水、油雾、尘埃，内部不锈钢丝网可清洗，使用寿命长。

发酵车间的空气过滤器二、培养基和灭菌（一）培养基C源：N源：无机盐：前体，促进剂，抑制剂2.培养基的类型孢子培养基：一般用固体培养基，N源不能丰富如：小米或麸皮培养基种子培养基：速效的C,N源，与发酵培养基过渡发酵培养基：迟效与速效的C,N源搭配，加前体等（二）灭菌方法1.空罐灭菌：高压水蒸气，消灭死角当培养基（或物料）尚未进罐前对罐进行预先灭菌蒸汽下进上出2.实罐灭菌：效果最好，121度，30-50分钟三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。3.连续灭菌：营养破坏最少，128-138度，8-12分钟。发酵的流程空气空气净化处理保藏菌种斜面活化扩大培养种子罐主发酵碳源、氮源、无机盐等营养物质灭菌产物分离纯化成品二、种子的制备

种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。谷氨酸生产的种子制备斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵1、斜面培养基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化钠0.5

琼脂2%，pH7.0-7.2培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：32℃，生长18-24小时生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过3次2.一级种子（摇瓶）培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32℃培养12h培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆2.5%，K2HPO40.1%培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基3.二级种子(种子罐)培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%(10%)），32℃培养7-10个小时培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。种子制备的过程二、微生物的发酵方式分批发酵补料分批发酵连续发酵一、分批发酵

简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。优点操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握缺点产率低，不适于测定动力学数据分批培养中微生物的生长迟滞期对数生长期稳定期死亡期迟滞期，菌体没有分裂只有生长。对数生长期,当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达到一定程度，细胞开始分裂，这时细胞生长很快。随着细胞生长，培养液中的营养物减少，废物积累，导致细胞生长速率下降，进入减速期和稳定期。最后当细胞死亡速率大于生成速率，进入死亡期对于初级代谢产物，在对数生长期初期就开始合成并积累，而次级代谢产物则在对数生长期后期和稳定期大量合成。二、补料分批培养在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用这种方法很多补料分批培养的优缺点优点在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。缺点由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌机会三、半连续培养补料分批培养基础上，加上间歇放掉部分发酵液进入下游提取的操作方式。某些品种采取这种方式，如四环素发酵优点放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量。缺点代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增大四、连续培养发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。1.罐式连续发酵培养液以一定的流速不断地流加到带机械搅拌的发酵罐中，与罐内发酵液充分混合，同时带有细胞和产物的发酵液又以同样流速连续流出。如果用一个装置将流出的发酵液中部分细胞返回发酵罐，就构成循环系统。2.管式连续发酵发酵液通过没有混返的管状反应器向前流动管道的形式有多种，如直线形、S形、蛇形管等。培养液和从种子罐来的种子不断流入管道发酵器内，使微生物在其中生长。这种连续发酵的方法主要用于厌氧发酵。如在管道中用隔板加以分隔，每一个分隔等于一台发酵罐，就相当于多罐串联的连续发酵。

连续培养的优缺点

优点：控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量。通过改变稀释速率可以比较容易的研究菌生长的动力学缺点：菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。发挥菌种的最大生产潜力考虑之点菌种本身的代谢特点，生长速率、呼吸强度、营养要求（酶系统）、代谢速率菌代谢与环境的相关性，温度、pH、渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等三、发酵过程中的中间分析项目（一）产量发酵液中发酵产物的积累，以发酵单位表示化学测定法：简单，但受结构类似物的影响，发酵过程中采用。生物测定法：麻烦，人为误差大。发酵终点采用（二）PHpH与微生物的生命活动密切相关-酶催化活性pH的变化又是微生物代谢状况的综合反映-基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供氧状况（三）糖糖的消耗反映产生菌的生长繁殖情况；反映产物合成的活力菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通过糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调节pH，促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵不正常。糖含量测定包括总糖和还原糖。总糖指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖。还原糖指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖。（四）氨基氮氨基氮指有机氮中的氮氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。通过氨基氮和氨氮的分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提取过程。（五）菌丝形态四、发酵过程的影响因素及控制发酵过程控制是发酵的重要部分同样的菌种，同样的培养基在不同工厂，不同批次会得到不同的结果，可见发酵过程的影响因素是复杂的，比如设备的差别、水的差别、培养基灭菌的差别，菌种保藏时间的长短，发酵过程的细微差别都会引起微生物代谢的不同。了解和掌握分析发酵过程的一般方法对于控制代谢是十分必要的（一）菌体浓度的影响及控制菌体浓度反应菌体细胞数和胜利特性结构越复杂的生物，分裂所需时间越长发酵中菌液需控制在合理浓度中，过高，营养消耗过快，有毒废物积累，改变菌体代谢途径，影响溶氧；过低，产率下降依靠调节培养基和补料控制菌体浓度（二）培养基的影响及其控制1.碳源葡萄糖速效碳源，生长菌体淀粉等迟效碳源，发酵次级代谢产物一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于半饥饿状态，在营养限制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率在较高水平。2.氮源氨基酸，玉米浆等速效氮源，生长菌体豆饼等迟效氮源，发酵次级代谢产物氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。3.磷酸盐和微量元素微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸盐为主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根抗生素对磷酸盐浓度很敏感生长浓度：0.32-300M生产浓度：1.0M采用生长亚适量磷酸盐浓度4.补料补基质和前体中途补料，丰富培养基，避免菌体过早衰老，控制PH，改善通气等通常在生长旺盛期后期，发酵液泡沫位下降，这时耗氧大，溶氧水平接近临界点补料少量多次（三）温度的影响及其控制1、温度影响反应速率发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适温度。另外，温度影响发酵液的物理性质2、温度影响发酵方向四环素产生菌金色链霉菌同时产生金霉素和四环素，当温度低于30C时，这种菌合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例也提高，温度达到35C时，金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。1.影响发酵温度变化的因素(1)生物热微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。(2)搅拌热(3)蒸发热通气时，引起发酵液的水分蒸发，水分蒸发所需的热量叫蒸发热(4)辐射热发酵罐内温度与环境温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。2.温度的选择与控制(1)最适温度的选择嗜冷菌适应于0～26度生长，嗜温菌适应于15～43度生长，嗜热菌适应于37～65度生长，嗜高温菌适应于65度以上生长最适生长温度不一定最适生产（发酵）温度最适发酵温度受菌种、培养基、培养条件和菌体生长阶段等影响。理论上来讲，发酵过程不应只选一个温度，应根据不同阶段选择不同的培养温度：生长阶段：最适生长温度产物分泌阶段：最适生产温度实际中……发酵前期要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。发酵后期，产物合成能力降低，提高温度，刺激产物合成到放罐。如四环素生长阶段28C，合成期26C后期再升温；黑曲霉生长37C，产糖化酶32～34C。但也有的菌种产物形成比生长温度高。如谷氨酸产生菌生长30～32C，产酸34～37C。(2)温度的控制冷却水（四）pH的影响及其控制pH与微生物的生命活动密切相关——

酶催化活性pH的变化又是微生物代谢状况的综合反映——基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供氧状况通过观察pH变化规律可以了解发酵的正常与否1、发酵过程的pH控制发酵过程中pH是不断变化的，通过观察pH变化规律可以了解发酵的正常与否2、产物形成某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。3、菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升实例：pH对林可霉素发酵的影响林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间产物，发酵液pH下降，待有机酸被生产菌利用，pH上升。若不及时补糖、(NH4)2SO4或酸，发酵液pH可迅速升到8.0以上，阻碍或抑制某些酶系，使林可霉素增长缓慢，甚至停止。对照罐发酵66小时pH达7.93，以后维持在8.0以上至115小时，菌丝浓度降低，NH2-N升高，发酵不再继续。发酵15小时左右，pH值可以从消后的6.5左右下降到5.3，调节这一段的pH值至7.0左右，以后自控pH，可提高发酵单位。发酵过程pH变化的原因

（1）糖代谢：特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一（2）氮代谢：当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。（3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降1.调节好基础料的pH。基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要调到6.5－6.8２.在基础料中加入维持pH的物质，如CaCO3

，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等３.通过补料调节pH４.当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH（五）溶氧的影响及其控制溶氧(DO)是需氧微生物生长所必需。在发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成为控制因素。供氧不足，代谢异常通气，搅拌1.溶氧的影响在28℃氧在发酵液中的100％的空气饱和浓度只有0.25M左右，比糖的溶解度小7000倍。在对数生长期即使发酵液中的溶氧能达到100％空气饱和度，若此时中止供氧，发酵液中溶氧可在几秒（分）钟之内便耗竭，使溶氧成为限制因素2.发酵过程的溶氧变化发酵初期，生产菌大量繁殖，需氧，溶氧下降过了生长阶段，需氧减少，溶氧上升发酵中后期，分批发酵的溶氧不变生产后期，菌体衰老，溶氧上升溶氧异常变化：明显降低或升高，常见是溶氧下降。（原因：耗氧或供养出现了异常因素或发生了障碍，见p273）3.溶氧浓度的控制通气，搅拌补料调节温度（降低培养温度能提高溶氧浓度）液化培养基中间补水添加表面活性剂（六）CO2的影响及控制CO2是微生物代谢产物，溶解在发酵液中的CO2对发酵有刺激或抑制作用CO2和HCO3影响膜的结构CO2使PH下降影响菌体的呼吸速率等CO2对产物抑制，则降低浓度，对产物促进，则增加浓度降低通气搅拌，则增加CO2在发酵液中溶解度（七）发酵过程泡沫的形成与控制发酵过程起泡的利弊：气体分散、增加气液接触面积，但过多的泡沫是有害的泡沫产生的