讲动物细胞生物制药应用举例

第四篇

生物制品生产

第8讲

动物细胞生物制药第3节

动物细胞生物制药应用举例1896192019872006本讲主要内容1.杂交瘤技术生产单克隆抗体2.病毒疫苗生产3.海洋生物制药4.动物细胞培养生物制药的问题与发展方向本讲关键问题1.杂交瘤生产单克隆抗体的制备原理与技术流程2.灭活病毒疫苗生产流程第一部分杂交瘤技术生产单克隆抗体新型人源化单克隆抗体可靶向并杀死癌细胞2013年3月26日PNAS:加州大学圣地亚哥分校研究人员研制出一种人源化单克隆抗体，可以靶向和直接杀死慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞。CLL细胞高水平表达一种细胞表面糖蛋白受体CD44。RG7356的单克隆抗体可以特异性靶向CD44，对癌细胞产生直接毒性作用，且对正常B细胞影响甚微。单抗药物相关数据显示，单抗药物2010年全球销售额达480亿美元，成为销售额最高的生物制剂。至今，共有29只单抗药物被FDA批准上市，而单抗销售额占整个生物药物市场的35%。业内人士预计，到2014年，全球前六大畅销药物将均为生物技术药物，而全球十大畅销药物中将有7只是生物技术药物，其中6只为重组抗体类药物。然而，国产单抗产品正处在起步阶段，目前已经上市的抗体只有9只，绝大多数在临床研究或已经上市的品种为完全仿制国外上市的产品。有分析预计，未来10～20年是我国单抗药物市场快速增长时期，单抗仿制药物在我国面临巨大的发展机遇。问题回顾：什么是细胞融合？有什么优点或作用？细胞融合（Cell

fusion）是指使用人工方法使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。体细胞杂交：克服有性不亲和性，实现远源遗传重组，在育种方面意义重大。杂交瘤细胞：具有两亲本特性，生物制药。基础知识回顾（一）免疫学基础1.抗原进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用的外源物质。包括：蛋白质、多糖、核酸、病毒、细菌、各种细胞等。特点：外源性、结构性（分子具有表面具有稳定的环状结构基团作为识别位点）、特异性（抗原与抗体的反应）。2.抗体动物免疫系统分泌的中和或消除抗原物质的影响的物质，存在于血清中，本质是免疫球蛋白（Immuniglobulin,Ig）。互补性决定区（Complementaritydetermining

region，CDR）

VH和VL的三个高变区共同组成Ig的抗原结合部位（Antigen-bindingsite）。该部位形成一个与抗原决定簇互补的表面，决定抗体的多样性与特异性。多克隆抗体与单克隆抗体动物脾脏有上百万个B淋巴细胞，一个细胞就是一个克隆，它针对抗原上的一个抗原决定族产生的抗体是单克隆抗体。一种抗原通常具有多个不同的抗原决定族，因此能刺激多个B淋巴细胞产生相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定族的单克隆抗体混合物，称为多克隆抗体。问题的引出血液得到的只能是混合抗体，但是需要大量的仅针对某一个抗原决定族的单克隆抗体，几乎是不可能的，因此必须采用其他方法。如果我们能分离得到只分泌某一种特异性抗体的B淋巴细胞，不就可以大量生产相关单抗了吗？问题：可以实现吗？有什么技术限制吗？很难离体培养B淋巴细胞。

（一）历史发现1975年，英国剑桥大学分子生物学研究室将已适应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫小鼠脾细胞（B淋巴细胞）进行融合，发现融合形成的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征：即像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能够无限地快速增殖，又能持续地分泌特异性抗体。

科勒（Kohler）米尔斯坦（Milstein）（二）杂交瘤技术将骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合得到即能够分泌抗体又能在体外长期繁殖的杂交瘤细胞，经过克隆化培养得到可以分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，这种技术通称为杂交瘤技术（hydridoma

technique）。（三）单克隆抗体应用领域单克隆抗体的特点是：理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强，广泛应用于生物学和医学研究领域：1.作为生物治疗的导向武器2.作为免疫抑制剂3.探针4.作为医学检验试剂5.作为亲合层析的配体（四）技术流程视频：/v_show/id_XMTY1ODg5MDI0.html1.动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备一般要经过初次免疫、第二次免役（向动物腹腔内注射抗体）、加强免疫（向动物静脉内注射抗体）三个过程。如果需要免疫脾细胞，一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液。2.骨髓瘤细胞的获得与培养骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高。通常采用HPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）与TK（胸腺嘧啶核苷激酶）缺陷型的骨髓瘤细胞系。一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期。

3.细胞融合（1）取对数生长的骨髓瘤细胞，离心，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。（2）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，离心，弃上清，用滴管吸净残留液体。（3）30秒内加入预热的一定浓度、一定分子量的PEG，边加边搅拌，在室温下融合。加预热的不完全培养液，终止PEG作用。（4）离心，弃上清，用20％小牛血清等轻轻混悬。将融合后细胞悬液加入96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培养。4.融合细胞的筛选融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体等。正常的脾细胞在培养基中存活仅5～7天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。剩余：脾细胞与瘤细胞的融合细胞+未融合的瘤细胞+融合的瘤细胞和瘤细胞，其中后两种需进行特别的筛选去除。HAT培养基筛选法培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T），所以取三者的字头称为HAT培养基。筛选原理DNA的合成：正常途径：糖、氨基酸——核苷酸——DNA

，可以被氨基蝶呤阻断胸腺嘧啶核苷激酶（TK）补救途径：核苷酸前体

——核苷酸——DNA

次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）需要以上两种酶的参与（1）氨基蝶呤可阻断细胞正常途径合成DNA，因此HAT培养基上的细胞不能采用该途径合成DNA。（2）融合所用的瘤细胞一般是HPRT与TK缺陷型，因此也不能采用补救途径合成DNA。两条途径被阻断后，有怎样的结果呢？瘤细胞（未融合的和多聚体）命运：因不能正常合成DNA而死亡。融合细胞：具有亲代双方的遗传性能，具有来自于淋巴细胞内的HPRT与TK

，因此可利用培养基中的嘌呤与嘧啶采用补救途径合成DNA，因此可在HAT培养基中存活与繁殖。5.克隆化培养将融合的细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在0至数个细胞之间，培养一段时间后取上清以ELISA法选出抗体高分泌性的细胞。找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后冻存、体外培养或动物腹腔接种培养生产抗体。6.分泌抗体的融合细胞的筛选酶联免疫吸附法（ELISA）EILSA主要是基于抗原或抗体能吸附至固相载体的表面并保持其免疫活性，抗原或抗体与酶形成的酶结合物仍保持其免疫活性和酶催化活性的基本原理。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，形成的抗原抗体复合物，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。7.单克隆抗体的大量生产（1）实体瘤法对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107cells／ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2

ml。待肿瘤达到一定大小后(一般10～20天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mg／ml。采血量有限。（2）腹水制备法腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5～20mg/ml，

这是目前最常用的方法。（3）生物反应器培养杂交瘤细胞大规模生产单抗杂交瘤细胞生物反应器培养液离心除去细胞，收集上清液提取抗体。（五）应用举例问题及方向用小鼠制备的鼠源性单抗属于异源性蛋白，在人体内会引起排异反应，有非常严重的毒副作用，制约了其在临床的广泛应用。人单克隆抗体：生产过程和鼠的单抗一样，只是采用认得B细胞和人的瘤细胞。全人单克隆抗体不存在鼠源性异种蛋白的抗原性，不会被人体免疫系统攻击，安全。人源化单抗：则是制作出鼠的单抗后，利用基因操作手段，置换或者切除单抗基因中鼠源性的蛋白片断，弱化其在人体内的抗原性，达到疗效。我国首个人源化单克隆抗体药物获准上市2006年2月24日一种既能阻止关节变形、又能有效治疗重度银屑病的新药：上海中信国健药业有限公司自主研发的抗体类新药“注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白”（商品名为“益赛普”）上市。它通过特异性地与人体内的肿瘤坏死因子（TNF）结合，对TNF的活性起负调节作用，从而抑制人体骨关节内的炎症反应，具有治疗起效快、疗效显著的特点。由于采用了“全人源化”的重组融合蛋白，这一新药不良反应小。我国的人源化单抗药物进展肾移植是救治终末期肾病最佳治疗选择，免疫抑制剂在肾移植中的应用至关重要。选择合理的免疫抑制剂方案，减少毒副反应，改善肾移植者长期生存成为新趋势。2011年4月，由上海中信国健药业股份有限公司自主研发的人源化单抗健尼哌国内正式上市，用于肾移植诱导治疗，其可降低急性排斥发生率：将健尼哌加入基础免疫抑制方案后，移植后3个月急排发生率降低了43.7%，6个月急排发生率降低了40.2%；患者1年人肾存活率分别为100%、99.46%。健尼哌上市标志着我国抗体药物研发水平迈上新台阶。小结单克隆抗体药物第二部分病毒疫苗生产12月1日是什么节日？艾滋病：感染人类免疫缺陷病毒（HIV）后导致免疫缺陷，并发一系列机会性感染及肿瘤，严重者可导致死亡的综合征。RNA病毒，主要侵犯CD4T细胞、CD4单核细胞和B淋巴细胞。1959年在刚果发现。1981年12月1日，美国确认发现一种新的传染性疾病——艾滋病（人类获得性免疫缺陷综合征）。1984年确认HIV是引起艾滋病的罪魁祸首。截至2011年，全球有HIV携带者3420万人，仅2011年，就约有170万人死于艾滋病，其中有23万为不满15岁的儿童。加拿大西安大略大学2012年11月6日宣布，他们研制的艾滋病疫苗在第一阶段的人体临床试验中获得成功。March

29,

2013Jon

Cohen.

Science

10

May

2013.340.6133.667Science：HIV疫苗

困兽之斗？

SARS事件SARS是指严重急性呼吸系统综合症（Severe

AcuteRespiratory

Syndrome，SARS，传染性非典型肺炎）

。于2002年在中国广东首发，并扩散至东南亚乃至全球，2003年中期疫情消失。2004年1月19日，SARS病毒灭活疫苗获得国家食品药品监督管理局批准进入一期临床研究，12月5日完成。但是SARS病毒灭活疫苗并没有产业化。冠状病毒（Coronaviruses）SARS——10年后卷土重来2012年6月，埃及微生物学家Ali

Mohamed

Zaki首次报告了新冠状病毒——中东地区呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）。截止到5月6日，共计30例新型冠状病毒感染确诊病例，其中18人死亡。新冠状病毒的死亡率逼近65%，而SARS病毒虽然在全球造成775人死亡，但死亡率却只有11%。甲型H1N1流感病毒：2009年4月墨西哥猪流感造成数150多死亡事件，并在多个国家蔓延。H5N1禽流感：2011年仍有爆发。H7N9病毒：2013年2月发现H7N9病毒，由禽类传播，从上海扩散开来，受感染者中近20%会死亡。据《华尔街日报》（WSJ）报道，美国Greffex公司5月2日宣布，成功研发出了首个完整的H7N9禽流感疫苗。然而，从小鼠到人，还需经过大动物实验、临床前实验，再到三个阶段的临床试验。获得FDA的批准。而完成初期临床试验过程，至少也要几个月，长则数年。成功案例——天花疫苗天花是由天花病毒引起的传染病。传染性强、肆虐范围广、死亡率高。16-18世纪，超过60%全球人口遭受天花的威胁。1976年，全球推行天花疫苗接种。1980年5月，世界卫生组织宣布根除天花。11月2日：世界肺炎日。全球每年约有160万人死于肺炎链球菌疾病。红霉素不敏感几乎达到100%，青霉素达86%。1983年肺炎链球菌夾膜多糖疫苗PPV23诞生。2000年针对2岁以下儿童肺炎链球菌蛋白结合疫苗PPV7问世。世界第一大单个疫苗。其它：疫苗有效控制了麻疹、风疹、腮腺炎、白喉、破伤风、黄热病、流感和乙型肝炎等传染性疾病。（一）分类灭活疫苗：通过化学、物理或简单加热的方法使病毒失去在宿主体内生长复制的能力，但仍保留了病毒的免疫原性，接种人体后能产生对此病毒的抵抗力，这种将病毒杀灭后制备的疫苗被称为灭活疫苗。常用甲醛为灭活剂，灭活病毒核酸而不影响其抗原性。例如：流行性乙型脑炎疫苗、狂犬病疫苗、流感灭活疫苗。减毒活疫苗：采用自然法或人工法通过动物传代或细胞传代筛选对人毒性低的变异株病毒。常见的有脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗、流感温度敏感突变株疫苗、流行性腮腺炎疫苗、风疹疫苗、黄热病疫苗以及一些联合疫苗（如麻疹、腮腺炎、风疹联合疫苗）。基因工程疫苗、DNA疫苗等。病毒灭活疫苗病毒需要在敏感细胞中才能增殖。通过动物细胞培养繁殖病毒。大致步骤：1.找到病毒敏感细胞2.进行病毒的分离3.病毒生产4.动物实验5.I、II、III期临床实验6.灭活疫苗制品

（二）病毒生产方法1.动物接种：例如狂犬病毒，采用鼠、兔脑内接种后收取脑组织制成悬液。2.鸡胚、鸭胚接种：如马脑炎病毒采用10D龄鸡胚接种，收获全胚体液。3.细胞培养法：不同的病毒采用相应的敏感细胞，接种一定量的病毒，培养一段时间，冻融细胞，离心收获上清。一般流程：流行性乙型脑炎病毒灭活疫苗制备工艺地鼠肾——剪碎，胰酶消化——地鼠肾细胞悬浮液——培养——接种病毒感染细胞——培养2-3天收获病毒液——甲醛灭活（22度，8天）——灭活病毒液——安全及效力实验——半成品——分装——成品

（三）应用举例狂犬病毒（Rabies

Virus）疫苗生产狂犬病是由狂犬病毒（Rabies

Virus）

引起的人畜共患的传染病狂犬病毒属于弹状病毒科弹状病毒属。外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链RNA。是引起狂犬病的病原体。

人被患狂犬病的动物咬伤、抓伤或经粘膜感染均可引起狂犬病。感染者发病时呈高度兴奋状态，并伴有发热、头痛、恐怖不安、惊风怕声、肢体发麻、吞咽困难，一旦喝水即引起严重痉挛等症状，出现恐水现象，故又称“恐水症”（hydrophobia）。路易·巴斯德路易·巴斯德（Louis

Pasteur，1822年12月27日－1895年9月28日），法国微生物学家、化学家，微生物学的奠基人之一。倡导疾病细菌学说（胚种学说）和发明预防接种方法而闻名，他亦是第一个创造狂犬病和炭疽的疫苗的科学家。被视为细菌学之祖。早在1885年，路易•巴斯德证明狂犬病毒能通过兔神经系统重复传代而减毒，并制备出有效的疫苗首次用于人体免疫，从而开创了人用狂犬病疫苗的发展史。狂犬病毒疫苗发展史1908年Fermi通过在室温下用1%酚处理脑组织改进了巴斯德的方法，但是液中仍有高达100MLD50的残余毒力。1911年Semple在此基础上作了进一步改进，将脑组织悬液于37℃用酚固定、灭活，制备了无毒性的Semple疫苗。1925年Hempt通过补加乙醚处理，进一步确保了疫苗的无毒性。使用Semple疫苗后严重的神经麻痹事故的发生率在1/500-1/2000，这种疫苗目前在发展中国家仍在广泛使用。我国自1949年起，一直使用由羊脑制备的Semple疫苗，直至1980年停止使用