实验动物胚胎工程技术

实验动物胚胎工程技术第一页，共七十三页，2022年，8月28日第一节概述工程:通过构想、设计，按照人们的意愿制作、改造某一事物，以达到预想的目的。生物工程：

按照工程学原理，对生物体或生物大分子进行改造或利用，用于生产、研究、检定和创造新物种的综合性科学技术。

遗传（基因）工程蛋白质工程酶工程细胞工程微生物工程

胚胎工程

组织工程分子水平细胞水平组织水平第二页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/22

胚胎工程（Embryonicengineering）又称胚胎技术,是指用工程学的原理对动物的胚胎进行某种技术操作或改造，使之获得人们所需要动物的一系列生物技术的总称。一、胚胎操作基本技术

1.超数排卵和卵母细胞、精子、受精卵的采集

2.体外受精

3.胚胎性别控制

4.胚胎分割

5.胚胎培养

6.胚胎移植

7.胚胎冷冻保存二、体细胞克隆技术三、干细胞技术四、外源基因导入技术第三页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/23胚胎工程的应用1.畜牧业：通过建立超数排卵、受精卵/卵母细胞的采集、体外受精、胚胎切割、胚胎性别控制、体细胞克隆以及胚胎移植技术，加快良种家畜的繁殖和家畜品种的改良。第四页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/242.生物制药：通过转基因技术将具有药用价值的生物活性蛋白的基因整合到宿主的染色体上，使其在乳汁、血液、尿液等体液中表达。通过收集、纯化这些体液中的生物活性蛋白，用于预防和治疗某些人类的疾病。已在乳腺表达的生物活性蛋白并进入临床2期或3期试验：抗凝血酶一Ⅲ抗胰蛋白酶蛋白C乳铁蛋白乳糖酶第五页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/253.医学：通过建立卵母细胞的采集、体外受精、显微受精以及胚胎移植技术，用于不孕症的治疗；通过对胚胎培养和检测，剔除具有遗传性疾病的胚胎，达到优生优育的目的。4.生命科学研究：阐明哺乳动物早期胚胎发生、发育机制等基础理论。5.拯救濒危野生动物：通过野生动物生殖细胞和组织的冷冻保存、体细胞克隆和胚胎移植技术，扩大野生动物的种群。第六页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/26第二节胚胎操作基本技术第七页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/27胚胎操作的整个过程局限在胚胎的早期发育第八页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/28一、精子、卵母细胞、受精卵的采集和超数排卵1.精子的采集

啮齿类小动物精子的采集大都从体成熟雄性动物的附睾获取。将动物处死后，分离附睾尾部，用眼科剪子在顶端剪一小口，用手指轻柔挤出浓稠的液滴，置培养液中培养。大动物的精子采集可采用假阴道或电刺激法促进雄性射精，收集精液。解剖取附睾尾部精子的获取和培养第九页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/292.卵母细胞和受精卵的采集

从体内成熟并排到输卵管中去，需通过处死动物或外科手术获取卵母细胞；如果在交配后，则可获取受精卵或早期胚胎。取自屠宰淘汰的或刚死亡的雌性动物的卵巢，从卵巢中分离卵母细胞经培养而得。小鼠解剖取输卵管从输卵管壶腹部取卵母细胞/受精卵的方法第十页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/2103.超数排卵（Superovolation）技术：通过注射激素刺激卵巢大量排卵。经超数排卵处理，动物卵巢大量的卵泡同时成熟并排出，排卵数可增加几倍至十几倍，一次可获得大量的卵细胞、受精卵或早期胚胎。所用激素有促卵泡激素（FSH）、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和孕马血清促性腺激素（PMSG）、孕酮和前列腺素（PG）等，以前三种常用。第十一页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/211检查阴栓：妊娠0.5天中午12时中午12时上午8时24小时24小时20小时注射PMSG注射HCG小鼠超数排卵程序放到种公鼠笼内受精卵注射PMSG注射HCG晚上5-6时晚上5-6时24小时24小时卵母细胞采集15小时第十二页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/212二、体外受精体外受精（Invitrofertilization）是指成熟精子与卵母细胞在体外环境下完成受精的过程。这一过程包括卵母细胞的收集或未成熟卵母细胞的培养成熟、精子的获取、获能处理、受精及受精后胚胎培养等。

体外受精（IVF）联合胚胎移植技术又称试管婴儿技术。第十三页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/213三、胚胎性别控制性别控制的研究，是畜牧业生物技术中一项重要的高新技术。这项技术的应用，可以使畜牧上大动物的繁殖按照人们的意愿只生产同一性别动物。在医学上，性别控制的研究也具有积极的意义。有的遗传性疾病属于性连锁遗传，例如进行性肌营养不良，为X连锁隐性遗传，男性发病，女性携带异常基因但不发病。携带此致病基因的女性怀孕后如做胚胎性别鉴定，则可避免男性患儿的出生。第十四页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/214性别控制技术通过对X精子与Y精子分离以控制性别。在胚胎移植前对胚胎的性别进行鉴定以控制性别。通过控制饲料特性、受精环境如改变精液或阴道的PH值等来控制性别。第十五页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/215（一）分离X精子与Y精子以控制性别分离X精子与Y精子的依据：X、Y精子在体积、密度、电荷、运动性和DNA含量、表面抗原等方面存在差异。将X和Y精子分离再通过人工授精可以有效地达到性别控制的目的。目前将X和Y精子分离的方法有沉降法、电泳法、免疫法和流式细胞仪法等。流式细胞仪法是当前分离X、Y精子较准确的方法，具有重复性、科学性和有效性的特点。第十六页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/216应用流式细胞仪分离X和Y精子的原理：X精子的DNA含量比Y精子的高。对于奶牛，X精子比Y精子DNA含量高3.8％，由于染料着色量与精子DNA含量成正比，因此X精子吸收的染料多，发出的荧光就比Y精子强。正常人染色体第十七页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/217具体的做法：先用DNA特异性染料对精子进行活体染色，然后精子连同少量稀释液逐个通过激光束。探测器根据精子的发光强度把电信号传递给计算机，计算机指令液滴充电使发光强度高的液滴带正电，弱的带负电。即X精子带上正电荷，Y精子带上负电荷。当经过高压电场时会向不同方向偏转，达到分离的目的。第十八页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/218（二）对胚胎进行鉴定以控制性别

在胚胎移植前对胚胎的部分组织用染色体检查、间接免疫荧光法和PCR法进行性别鉴定。其中PCR法因有可靠的操作程序，具有高效、快速的特点，近年来得到迅速的发展。

Y染色体短臂上有决定雄性的DNA片段-SRY基因(sex-determiningregionofY-chromosome,全称:Y染色体性别决定区)，为胚胎性别鉴定提供了可靠的途径。第十九页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/219第二十页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/220四、胚胎培养

胚胎培养是指将获得的早期胚胎在体外人工环境中进行培养，以观察其发育或人工干预某一发育过程的可能性。受精卵2细胞胚4细胞胚8细胞胚桑椹胚囊胚第二十一页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/221胚胎培养一般应用于以下几个方面：1.未成熟卵母细胞通过体外培养，成熟后进行体外受精。2.受精卵通过体外培养发育成各阶段的早期胚胎，用于胚胎移植或胚胎冷冻保存。3.冷冻保存胚胎解冻后，通过体外培养，筛选成活胚胎用于胚胎移植。4.通过研究胚胎发育的环境和条件，不断完善胚胎培养条件，揭示胚胎细胞的生长发育和分化的奥秘。目前胚胎培养技术已经可以将未成熟卵在体外成熟，并通过体外受精发育成各阶段的早期胚胎。即使如此，在体外胚胎培养也只能发育到囊胚期，需要在囊胚期前移植到动物的子宫内。第二十二页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/222五、胚胎移植---胚胎工程的最后一道工序

将受精卵或发育到一定时期的早期胚胎,移植到受体动物生殖管道的一定部位,能在子宫内着床、生长、发育、分娩、出生仔代动物的技术称为胚胎移植。几乎所有的胚胎工程技术在体外完成对胚胎的操作后，都需经过胚胎移植这一步骤，得到我们所要的动物。第二十三页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/223体外培养的胚胎必须移植到同步发情的雌性动物生殖管道内。1.利用自然同期发情的母畜，此法在实践上较难办到。2.通过注射某些激素(如孕激素、雌激素等)诱发同期发情。

不同发育阶段的胚胎移植的部位不同。

受精卵和2细胞胚胎应移植到输卵管内，而桑椹胚和囊胚期胚胎应移植到子宫内，以跟正常妊娠生殖生理变化同步。第二十四页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/224同一种属内的不同品种品系可互相进行胚胎移植。如近交系C57BL/6J小鼠的胚胎可移植到雌性封闭群ICR的生殖管道内；日本大耳白兔的胚胎可移植到雌性新西兰兔的生殖管道内。这一特点在畜牧业特别有用，如为了加快良种奶牛的繁殖，可将良种奶牛的胚胎移植到普通黄牛的生殖管道内，借腹怀胎。第二十五页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/225六、胚胎冷冻保存胚胎冷冻保存（embryocryopreservation）技术是指在低温（-196℃液氮内）条件下利用低温保护剂保存生殖细胞及胚胎的一门技术。第二十六页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/226（一）胚胎冷冻保存的机制

低温降低了胚胎内的生化反应速度。并且温度越低，保存时间就越长。低温损伤：如果冷却速度过慢，胞外溶液中水分大量结冰，溶液浓度提高，胞内水分大量渗出，导致细胞的强烈收缩和细胞处于高浓度的溶液中时间过长，从而造成化学损伤；如果冷却速度过快，胞内水分来不及通过细胞膜向外渗出，胞内溶液过冷而结冰，从而造成物理损伤。在复温（解冻）过程中，如果复温速率不当也可能引起细胞内结冰（重结冰）而损伤。第二十七页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/227采用低温保护剂防止低温损伤：

二甲基亚砜（DMSO）、聚乙烯砒咯烷酮(pvp)、甲醇、乙二醇、羟甲基淀粉（HES）等可以避免或减少结冰的程度与速度，降低细胞周围未冻结溶液中的电解质浓度，从而避免或减少胚胎冷冻过程中所发生的物理和化学损伤。第二十八页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/228

（二）胚胎冷冻保存技术的应用

1.应用于实验动物的育种和保种。⒉应用于实验动物胚胎的长途运输。⒊应用于实验动物的生物净化。⒋应用于珍稀或濒危动物种质保存。第二十九页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/229第三节动物体细胞克隆技术第三十页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/230克隆（clone）的概念克隆是指无性繁殖或拷贝。无性生殖在植物中很常见，在动物中过去认为是不可能的。动物克隆是指动物通过体细胞核移植后生产出基因型几乎与供体完全相同的后代。第三十一页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/231

核移植（Nucleartransfer）是指将动物细胞的细胞核移植到另一个体的去核卵母细胞胞质中，通过电激活，使供体核重编程序，形成的重构卵在体外培养成胚胎，最后通过胚胎移植，使之发育成个体。如果受体去核卵和供体移入的核来自同种动物，则称种内核移植，来自不同的种则称为种间核移植。核移植由于没有经过精子和卵子的受精过程，核移植动物的全部遗传信息来自供体核细胞，等于是复制了提供细胞核的动物，因而把它俗称为“克隆”。

第三十二页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/232根据供体核的来源不同，核移植包括以下几种：

胚胎细胞核移植：未着床前的囊胚（未分化）胚胎干细胞核移植（未分化）胎儿成纤维细胞：出生前的胎儿（未分化或低分化）成年体细胞（已分化）第三十三页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/233动物克隆的实验过程第三十四页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/234动物克隆技术的意义与应用加快良种家畜的繁殖速度与体细胞转基因技术结合，能制备大家畜转基因动物拯救濒危野生动物治疗性克隆，用于再生医学第三十五页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/235再生医学技术路线简介第三十六页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/236第四节干细胞技术第三十七页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/237一、概述干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞。根据发育阶段，可将干细胞分为胚胎干细胞(embryonicstemcells，ES细胞)和成体干细胞(adultstemcells，AS细胞)。ES细胞存在于囊胚期胚胎的内细胞团中，是全能性、无限增殖的干细胞，在胚胎的生长发育过程中具有分化形成胎儿所有类型细胞、组织和器官的潜能。AS细胞是ES细胞定植于胎儿和成人的各种组织和器官中的“种子”，具有自我更新和分化为组织特异细胞的能力，即分化为相应组织和器官中细胞的“专能”细胞，包括神经干细胞、脂肪干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、精原干细胞、皮肤干细胞和肝脏干细胞等。第三十八页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/238第三十九页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/239诱导性多潜能干细胞(Inducedpluripotentstemcells,iPS细胞)2006年,Takahashi等首次发现导入特定的转录因子基因能够使已分化的细胞重编程回归到胚胎细胞状态。他们通过慢病毒载体介导将Oct4、Sox2、c-Myc和Klf44种转录因子基因导入小鼠皮肤成纤维细胞,获得了具有强大的自我更新能力和分化潜能的多能性干细胞,命名为iPS细胞。这一研究克服了ES细胞和AS细胞应用存在的诸多问题，展现了广阔的应用前景，受到了整个生命科学领域的广泛关注。目前研究中较为理想的供体细胞主要有淋巴细胞(如T细胞和B细胞等)、脂肪细胞和皮肤成纤维细胞。第四十页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/240二、胚胎干细胞（ES细胞)来源：ES细胞是从胚胎发育早期囊胚（人胚胎受精后约5-7天，小鼠胚胎受精后3-4天）中的内细胞群分离出来的未分化细胞。内细胞群:具有未分化特性，可进一步分裂,分化形成内、中、外三个胚层。外胚层将分化为皮肤、眼睛和神经系统等中胚层将形成骨骼、血液和肌肉等组织内胚层将分化为肝、肺和肠等由于内细胞群可以发育成完整的个体，因而这些细胞被认为具有全能性。当内细胞群分离出来后在体外培养时，我们称之为ES细胞。第四十一页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/241

目前除了从小鼠、大鼠和人分离得到并建立ES细胞系外，还未从其它动物的囊胚中分离到ES细胞系。第四十二页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/242（二）ES细胞的培养

ES细胞的培养条件极其苛刻，对培养液、试剂、胎牛血清、水等均需采用胚胎级，对培养器皿等必须清洗干净。一旦条件不适合，ES细胞容易发生分化，从而失去ES细胞的特性。

未分化ES细胞的培养一般需要与用丝裂霉素处理过的成纤维细胞饲养层（Feedercell）共培养，饲养层细胞为ES细胞提供细胞因子来维持其未分化状态。在培养液中加用白血病抑制因子（LeukemiaInhibitoryFactor，LIF）能更有效地维持未分化的ES细胞。第四十三页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/243（三）ES细胞的鉴定

ES细胞是一种正常的胚胎性干细胞，具有正常的染色体核型和体内外分化的潜能。在建系之初需要对其核型、分化能力和细胞标志物进行鉴定

1．核型

2．体外分化试验将ES细胞在无饲养层、低胎牛血清的培养液中悬浮培养，数天后形成胚样小体（embryoidbodies）的内皮样大型细胞团；向成纤维细胞、心肌细胞以及造血细胞的分化。

3．体内分化试验将ES细胞悬液注射到同性别小鼠的腹股沟皮下，2周后注射部位出现肿块，病理检查为畸胎瘤。畸胎瘤内部有多种细胞生长，如上皮细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、神经细胞、成纤维细胞以及干细胞集落等，也可看到各胚层组织的分化，如软骨、肌肉组织、上皮组织及腺体等。

4．ES细胞的标志物

Oct-4:Oct-4（也叫Oct-3或Oct3/4）属POU转录因子一员，它在全能胚胎干细胞(ES)和生殖细胞表达。该表达对于维持干细胞的自我更新和多能性是必要的。ES的分化导致Oct-4的下调。

SSEAs:人ES细胞表达SSEA-3和SSEA-4，但不表达SSEA-1。小鼠ES细胞表达SSEA-1，但不表达SSEA-3或SSEA-4。

第四十四页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/244（四）胚胎干细胞的应用1.用于研究哺乳动物个体的发生发育规律

由于ES细胞可分化为胚胎内胚层、中胚层和外胚层中任何一种类型细胞，因此可用遗传标记的ES细胞(如标记半乳糖苷酶基因)注入囊胚腔，通过组织化学染色追踪ES细胞的分化特点，探索胚胎发育过程中细胞分化、组织和器官形成的规律。小鼠的ES细胞已成为研究哺乳动物早期发育规律的重要工具之一。第四十五页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/245

2.在体外研究细胞的分化规律

ES细胞仅在饲养层细胞上或在添加白血病抑制因子(LIF)或白细胞介素-6(IL-6)的培养液中维持不分化状态。当培养液中添加分化诱导剂，如牛黄酸(RA)、二甲基亚砜(DMSO)、丁酰环腺苷酸和3-甲氧基苯甲酰胺等，可诱导ES细胞发生不同类型的分化，通过研究ES的分化特点可揭示细胞分化和凋亡机理。第四十六页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/2463.用于研究基因的功能和制备基因敲除动物

由于用ES细胞可进行基因打靶，容易获得基因敲除或定向插入外源基因的ES细胞，因此是基因敲除和基因插入的首选细胞。通过筛选获得阳性细胞，然后用嵌合体或细胞核移植技术获得转基因动物。用于研究未知基因的生物学功能。第四十七页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/2474.治疗人类的某些难治性疾病

人类由于细胞坏死、退化或功能异常引起的疾病，如帕金森综合症、少年糖尿病和老年痴呆症等，已成为医学上尚未攻克的顽症。利用ES细胞可以诱导分化形成新的组织细胞的特性，移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能。目前，在动物实验方面，用ES细胞诱导分化出的某些组织细胞已成功地治愈糖尿病、肝衰竭、心衰竭和成骨不良等疑难病症。第四十八页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/2485.培育出人造组织器官，用于器官移植

随着组织工程技术的发展，通过ES细胞体外诱导分化，还可以培育出人造组织器官，解决目前临床上存在的供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题。第四十九页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/249三、成体干细胞1.成体干细胞（AS细胞）的来源AS细胞位于出生后体内分化成熟的组织之中，具有自我更新和分化潜能，它在分裂时可产生两个子代细胞，一个与原来干细胞完全一致，另一个向前分化，形成相应组织的多功能干细胞，通过分化增殖和更新衰老细胞来构筑相应的器官，维持正常生理功能。现在可从骨髓和血液、胎盘、脐带、肌肉、大脑、皮肤、脂肪、滑膜等多种组织中获取各种多能干细胞。第五十页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/2502.AS细胞的培养和诱导定向分化取所要分离AS细胞的组织，用酶消化法分散细胞进行体外培养。再用各种技术从体外培养细胞中分离AS细胞，如用免疫磁珠分离系统分离乳腺AS细胞。同ES细胞一样，AS细胞的诱导定向分化需要细胞因子、激素等刺激，如IL-l、IL-11、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）等。通常情况下，供体干细胞在受体中分化为与其组织来源一致的细胞。然而在某些情况下干细胞的分化并不遵循这种规律，如神经外胚层来源的NSC能分化为中胚层来源的细胞如肌细胞，肌肉干细胞会分化为各种血细胞系等。所有干细胞中，来源于骨髓的干细胞在多向性分化方面具有较大的潜能，分为造血干细胞(HSC)和骨髓间质干细胞(MSC)。第五十一页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/2513.AS细胞的鉴定

各种AS细胞都有自己的标记物，可利用标记物进行鉴定。4.AS细胞的应用

疾病的替代治疗和移植治疗

如用造血干细胞治疗白血病，将造血干细胞在体外诱导分化成心肌细胞来修复受损伤的心肌，治疗心力衰竭。骨髓来源干细胞及其他来源干细胞都可以分化得到成骨细胞，通过将细胞与支架材料结合后移植于骨骼受损部位，用于修复骨骼缺损。第五十二页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/252四、诱导性多潜能干细胞1.iPS细胞的来源iPS细胞建立的过程主要包括:①

分离和培养宿主细胞；②

通过病毒介导或基因转染的方式将若干个多能性相关的基因（Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4）导入宿主细胞；③

将基因导入的细胞种植于饲养层细胞上,用ES细胞专用培养体系中培养,同时在培养液中根据需要加入相应的小分子化合物，以促进重编程。2.iPS细胞的培养和诱导定向分化

其培养条件和诱导定向分化的条件基本与ES细胞相同。3.iPS细胞的鉴定iPS细胞的鉴定与ES细胞相同。第五十三页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/253以病毒为载体，向老鼠的成纤维细胞中注入4个基因，将其改造为ｉＰＳ细胞，然后在此基础上培育出一个老鼠胚胎，再把它植入代孕实验鼠的体内。20天后，一只黑色的小老鼠出生。再生医学中如何获得病人ES细胞传统技术1.用病人的皮肤细胞核移植到人去核卵母细胞人卵母细胞来源问题2.用病人的皮肤细胞核移植到动物去核卵母细胞伦理问题新技术1.用ES细胞特异转录基因导入人皮肤细胞，直接转化成诱导多能干细胞（iPS）(2007年）安全问题2.miRNAs直接将皮肤细胞转化为iPS(2010年）3.4种小分子化合物组合直接转化体细胞为CiPS（2013年）第五十四页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/2544.iPS细胞的应用iPS细胞与ES细胞相比,具有很多优势。iPS细胞的来源更方便、更丰富，可以通过有限的几个转录因子基因转染，或相关RNA导入，或用小分子化合物直接诱导各种不同动物的体细胞来获取多能性干细胞，而不需要通过ES细胞途径，克服了许多动物至今未分离出ES细胞的问题。iPS细胞的产生不需要早期胚胎或者其他配子的参与，克服了使用人胚胎进行实验的伦理问题，可见iPS细胞必然成为未来相当长一段时间内的研究热点。目前,科学家们已经成功地从小鼠、大鼠、猕猴、猪和人的体细胞中诱导并获得iPS细胞。第五十五页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/255近期利用干细胞进行再生医学动物实验和临床试验的研究报导2013.1.28日本科学家利用iPS细胞成功再生毛囊日本庆应义塾大学的一个研究小组利用人类诱导多功能干细胞（iPS细胞），在实验鼠身体上成功再生了部分毛囊，为治疗脱发症开辟了新道路。2013.5.15日本科学家利用iPS细胞制成造血干细胞有望取代骨髓移植日本东京大学的研究人员利用能发育成各种细胞的诱导多功能干细胞（iPS细胞）制作出造血干细胞，并能生成淋巴细胞和红细胞等正常的血液细胞。这一成果有助开发替代骨髓移植的血液病治疗新方法。中国科学家用小分子化合物诱导体细胞重编程为iPS《Science》

北京大学生命科学学院邓宏魁教授和赵扬博士带领的研究团队用小分子化合物诱导体细胞重编程为多潜能干细胞。该成果开辟了一条全新的实现体细胞重编程的途径，给未来应用再生医学治疗重大疾病带来了新的可能。美国科学家成功利用诱导多能干细胞制造血管《分子治疗》美国麻省总医院的科学家发明一种新方法，成功将人诱导多能干细胞（hiPS）转化为血管，并在实验动物中长时间存活工作。该方法被认为是利用再生医学技术解决血管疾病问题的一项里程碑式成果。2013.12.3美国科学家首次将iPS细胞转化为功能性肺细胞《自然生物技术》美国哥伦比亚大学医学研究中心的科学家首次成功地将人体干细胞转化成了功能性的肺细胞和呼吸道细胞。这一最新成果可以帮助科学家们研究肺部发育、构建肺部疾病建模、筛查药物并最终制造出可供移植的肺部器官。澳大利亚昆士兰大学采用干细胞成功地培育出了肾脏《自然细胞生物学》研究人员设计出一种促进人胚胎干细胞在盘碟中形成自我组装成微型肾脏（mini-kidney）所需的所有细胞类型。第五十六页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/2562014.7.1日本科学家用诱导多功能干细胞治疗肌萎缩侧索硬化症日本京都大学教授井上治久率领的研究小组，利用iPS细胞制作出可变化为神经胶质细胞的前驱细胞，然后向24只患有渐冻症的实验鼠脊髓各移植了约8万个这种细胞。结果发现，移植了前驱细胞的24只渐冻症实验鼠的平均生存期为162天，而没有移植的24只实验鼠仅为150天。日本诱导多能干细胞首次获批进行人体实验《自然》治疗使用的iPS细胞由日本神户理化研究所（RIKEN）发育生物学中心的眼科专家高桥雅代培育而成，将用于治疗与年龄相关的视网膜退化疾病。高桥雅代从罹患这一疾病的患者那儿提取到了皮肤细胞，并将其转化为iPS细胞，接着，诱导iPS细胞变成视网膜色素上皮细胞，最后将其培育成能被植入受损视网膜内的纤薄层。美国斯坦福大学和哥伦比亚大学和奥地利科学院的科学家用iPS细胞治疗大疱性表皮松解症《科学转化医学》取患者的皮肤细胞进行培养，用病毒将矫正性的基因送入细胞诱导成iPS细胞，然后将这些细胞移植回患者腿部。这些细胞移植到小鼠身上之后，长成了人类皮肤，也生产了正确的胶原蛋白。日本科学家首次用成体干细胞培养出肾脏组织《干细胞》日本冈山大学和杏林大学的研究人员从成年实验鼠肾脏内采集了成体干细胞，在培养皿内制作出细胞团块，然后将细胞团块放入凝胶状物质中，再加入促其生长的特殊蛋白质。3至4周后，他们培养出了50至100个类似肾单位的立体管状组织。这些组织中含有肾小管和肾小球等结构，并具有部分肾脏的功能。日本科学家利用iPS细胞修复肌肉萎缩症基因《干细胞报告》日本京都大学研究人员利用诱导多功能干细胞（iPS细胞），成功修复了引发肌肉萎缩症的致病基因。这一成果将有望促进开发出改善肌肉萎缩症症状的方法。第五十七页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/257中国科学家使用小分子化合物直接诱导小鼠成纤维细胞重编程获得功能神经元《CellStemCell》北京大学生命中心邓宏魁研究组取得的一项重要研究成果：使用小分子化合物组合直接将小鼠成纤维细胞重编程成为了功能神经元。整个诱导过程不经历多潜能干细胞阶段和细胞增殖过程。该方法相比较传统的先诱导体细胞重编程获得多潜能干细胞，再分化获得功能细胞方法，直接重编程方法更加简单和直接，并有可能应用于体内直接重编程，成为一种新的治疗疾病的解决方案。澳大利亚与荷兰科学家用iPS培育出肾脏组织《自然》

澳大利亚与荷兰研究人员从诱导多能性干细胞(iPS)中，培育出“类似肾脏的组织”。诱导多能性干细胞是重新设定为中性状态的成体细胞，接着它们再受诱发分化成其他类型的细胞。中国科学家用ES细胞治疗阿尔茨海默病（AD）动物模型《干细胞报告》中科院上海生科院生化与细胞所景乃禾研究组成功地把小鼠和人胚胎干细胞诱导分化为成熟的功能性基底前脑胆碱能神经元（BFCN），将这些干细胞来源的BFCN移植到阿尔茨海默病（AD）动物模型脑内，可以有效改善模型小鼠的认知功能。2015.11.20日本科学家用iPS细胞育成心脏组织薄膜《Scientific

Reports》日本京都大学iPS细胞研究所山下润教授所带领的研究小组近日宣布，他们成功开发出能够延长“心脏组织薄膜”作用时间的新方法。心脏组织薄膜是该团队在2014年利用人类诱导多功能干细胞(iPS细胞)制作的多层叠加细胞层，通过将其移植到心脏外可改善心脏功能。第五十八页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/258第五节外源基因导入胚胎技术第五十九页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/259

将外源基因导入到胚胎内主要有以下几种方法：一、直接导入受精卵或早期胚胎内①显微注射法：在显微镜下利用玻璃显微注射针将外源DNA片段直接注入到受体的受精卵雄性原核内。②逆转录病毒载体法：将外源基因克隆到逆转录病毒载体，感染受体细胞时，外源基因可整合到宿主细胞染色体内。用于转基因和基因治疗。

③精子载体法：将外源DNA片段与动物精子一起孵育，在体外受精过程中由精子将外源DNA带入卵内。第六十页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/260二、将外源基因转染胚胎干细胞或体细胞，再将转染的细胞作为供体核移植到去核卵母细胞，发育成胚胎。

1.将外源基因转染胚胎干细胞或体细胞：

①电穿孔法：细胞暴露于高电压时，细胞膜为高电压瞬时击穿，从而使外源DNA片段被摄入细胞中。②脂质体法：脂质体是一种人造膜，将外源DNA装入脂质体，与培养细胞一起温育，即可将外源DNA导入受体细胞。③基因枪法：

④DEAE-葡聚糖介导法：⑤磷酸钙介导法：第六十一页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/2612.带有外源基因的ES细胞通过崁合体技术进入囊胚胚胎嵌合是指将遗传上不同的两类胚胎或胚细胞组合起来，形成一个胚胎，由此而发育形成的动物称为嵌合体动物。由于嵌合体动物是两类遗传背景不同的胚胎发育形成的，不同细胞群体互相嵌合构成了器官和组织，但嵌合体动物携带的两种遗传特性不能同时遗传给下一代的同一个体。究竟哪一个亲本的遗传特性能遗传取决于该亲本的细胞是否在嵌合体动物体内分化成生殖细胞（精子或卵子）。分化成生殖细胞的亲本的遗传特性能传给后代。第六十二页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/262嵌合体动物的制备：1.聚合法用聚合法制作嵌合体动物，是将遗传上不同（例如毛色不同）的两个8～16细胞胚胎用物理方法聚合起来。2.注射法

注射法是将胚胎干细胞或其他胚细胞注入桑椹胚或囊胚腔中来制作嵌合体动物。第六十三页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/2633.带有外源基因的体细胞通过克隆技术进入胚胎将带有外源基因的体细胞作为供体，通过核移植技术克隆到去核卵母细胞，在体外发育成囊胚，再移植到假孕动物的子宫中。出生后动物的基因型与供体的基因型完全一致。第六十四页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/264显微注射法逆转录病毒感染精子介导转基因电穿孔电穿孔脂质体转染磷酸钙转染生殖细胞或早期胚胎ES细胞体细胞外源DNA片段外源DNA片段外源DNA片段囊胚去核卵母细胞外源基因进入胚胎的途径和方法第六十五页，共七十三页，2022年，8月28日2023/2/265

外源基因进入细胞后的命运

外源DNA进入细胞后有三种命运：

1．被胞内核酸酶降解。

2．以游离状态存在。游离的未整合外源DNA只要有真核细胞能识别的启动子、编码基因以及poly(A)信号等，一般都能得到表达，但随着细胞衰老，表达力下降。这种表达不能传代，称为暂时表达。

3．整合到