临床PCR检验的质量保证

临床PCR检验的质量保证定义质量保证(QualityAssurance,QA)

为一产品或服务满足特定质量要求提供充分可信性所必要的有计划的和系统的措施。

定义室内质量控制（InternalQualityControl,IQC)

由实验室工作人员，采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本实验室工作的精密度，提高本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，以确定测定结果是否可靠、可否发出报告的一项工作。可概括为:(1)执行者：实验室技术人员；(2)目的：监测实验室测定的重复性；(3)功能：决定了当批测定的有效性，报告可否发出。是对实验室测定的即时性评价。

定义室间质量评价（ExternalQualityAssessment,EQA）为客观比较一实验室的测定结果与靶值的差异，由外单位机构，采取一定的办法，连续、客观地评价实验室的结果，发现误差并校正结果，使各实验室之间的结果具有可比性。这是对实验室操作和实验方法的回顾性评价，而不是用来决定在实时的测定结果的可接受性。当EQA用来为执业许可或实验室认证的目的而评价实验室操作时，常描述为实验室能力验证（Proficiencytesting,PT）。在以前的文献中，EQA常描述室间质量控制。定义批(Run)在相同条件下所获得的一组测定。（5个相同：地点、仪器、试剂、人员、时间）定义正态分布(Gaussiandistribution)

当一质控物用同一方法在不同的时间重复多次测定，当测定数据足够多时，如以横轴表示测定值，纵轴表示在大量测定中相应测定值的个数，则可得到一个两头低，中间高，中为所有测定值的均值，左右对称的“钟形”曲线，亦即正态分布，又称高斯分布。定义正态分布的基本统计学含义可用均数（X）、标准差（S或SD）和概率来说明。定义正态曲线以下的面积称概率，常用样本的均数（X）和标准差（SD）来表示，其计算公式：均值、标准差和概率的关系如下：

X±1SD，概率0.68；X±2SD，概率0.95；X±3SD，概率0.99临床基因扩增检验实验室

常规测定步骤标本收集：选择测定项目、标本收集和保存。实验室测定：标本接收、贴标签、样本处理、核酸扩增、产物检测、测定的有效性和临床诊疗价值。报告和解释：结果发出、结果解释和临床管理。质量保证、室内质控和室间质评之间的关系临床基因扩增检验的室内质量控制测定前的质量控制核酸样本的制备及其质量控制统计学质量控制质量控制的评价测定前质量控制实验室设施、仪器设备及管理理想的试剂和操作方法人员培训实验室设施、仪器设备及管理临床基因扩增检验实验室应有充分合理的空间、良好的照明和空调设备；实验室仪器设备应保养良好，实验用品要达到相应的要求。加样器的校准？带滤塞吸头的使用及质检？离心管的质检？离心机？热循环仪？水浴箱和/或恒温干浴仪？酶标仪和洗板机？实验室设施、仪器设备及管理

混样仪：维护、校准加样器：维护、校准核酸提取仪：维护、校准扩增仪：维护、校准恒温干浴仪或水浴箱：维护、校准离心机：维护生物安全柜：维护冰箱：维护基因扩增仪器设备的质控

离心管、吸头等的质检

带滤芯吸头的密封性离心管PCR抑制物质检

扩增仪的扩增功能检测

目的：通过扩增功能来间接获知孔间的均一性。方法：即将加有一已知的含一定浓度的阳性质控样本的扩增反应管置于扩增仪各孔中按常规进行扩增检测，观察结果的一致性程度，如果有某一个或几个孔结果有问题，则应确定这一个或几个孔是否会重复性地得到假阴性结果，如果是，则表明相应孔的热传导有损坏。理想的试剂和操作方法应对试剂准备、标本收集、核酸提取、测定方法和仪器操作写出“标准操作程序”(SOP：包括文件资料、实验室台前)理想的操作方法按照试剂盒说明书操作即可吗?操作中影响测定结果的关键环节写出具有可操作性的SOP质量管理的内涵写你所做的做你所写的记录你已做的分析你已做的XXX单位XXX实验室XXX标准操作程序编号：启用日期：版本：第页共页一目的：适用范围：职责或责任人：（方法原理）（检测设备和试剂）（所需的环境条件）操作步骤：

1．

2．

3．

五、本操作程序变动程序：六、相关的文件七、相关的记录表格和报告编写人审核人批准人怎样编写SOP？SOP（5W和1H）谁来做(Who)：责任人做什么(What)：适用范围何时（When）：适用范围何地（Where）：适用范围为什么做（Why）：目的如何做（How）：操作步骤可移动紫外灯的操作SOP（5W1H）谁来做(Who)具体的实验人员。（责任人）做什么(What)操作可移动紫外灯，用于实验台面、空间或仪器照射。（适用范围）何时（When）每次实验后。（适用范围）何地（Where）在PCR实验室每区内。（适用范围）为什么做（Why）消除或减少实验室核酸或扩增产物污染。（目的）如何做（How）即如何打开可移动紫外灯、调节到距被照射物的适当距离（60-90cm）、照射多长时间等。（操作步骤）

HBVDNA检测SOP（5W1H）谁来做(Who)具体的实验人员。（责任人）做什么(What)HBVDNA检测。（适用范围）何时（When）每天或每周的哪天。（适用范围）何地（Where）不同的工作（试剂准备、标本制备和扩增检测）在PCR实验室不同区内。（适用范围）为什么做（Why）保证HBVDNA日常检验不同技术人员操作的一致性。（目的）如何做（How）即试剂如何准备、样本如何预处理、核酸如何提取、扩增检测上机、结果分析、报告及解释等。（操作步骤）实验记录表格的设计存在问题表格种类繁多重复记录表格无实用性，用于检查的痕迹很重记录表格设计的基本原则信息充分简单明了临床标本的检测信息能有机联系起来临床PCR检验流程记录表检验日期

检验项目：

扩增仪中保存文件名：

使用说明：

1．本记录表须严格遵循试剂准备区标本制备区扩增区（产物分析区）单一流向移动，严禁逆向移动。

2．各项工作执行后，在相应叙述前的“”内打“”。

3．本记录表最后与相应的标本接收记录等归档保存于扩增区的专用文件柜内，以备查找。

实验前准备试剂在有效期内扩增仪、加样器和温度计在校准的有效期内生物安全柜的滤膜在使用有效期内消毒溶液在有效期内洗眼器内无菌生理盐水在有效期内离心管、带滤芯吸头已经过质检合格操作者：

试剂准备区（1区）

实验前：打开通风设备实验台面清洁（水或70%酒精擦拭）冰箱温度：冷藏室（2~8℃）

℃；冷冻室（18℃2℃）

℃实验室温度：

℃（允许范围：10~30℃）；相对湿度：

（允许范围：30%~80%）PCR试剂来源：（可直接列出有关厂家名称）批号：XXXXXXX检验项目：

本次实验用量：

人份，剩余量：

人份。其他有关试剂配制：按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制1%含氯消毒液

毫升；按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制4％NaOH溶液

毫升；按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制0.1%焦磷酸二乙酯

毫升；按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制

毫升；其他：仪器设备使用：离心机：正常不正常振荡器：正常不正常超净台：正常不正常实验后：按XXX（将有关SOP编号列出）SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外照射30分钟以上。按XXX（将有关SOP编号列出）SOP处理实验废弃物。操作者：标本制备区（2区）

实验前：打开通风设备实验台面清洁（水或70%酒精擦拭）冰箱（柜）温度：冷藏室（2~8℃）

℃；冷冻室（18℃2℃）

℃实验室温度：

℃（允许范围：10~30℃）；相对湿度：

（允许范围：30%~70%）阳性室内质控物来源：

浓度及批号：

扩增位置：

阴性室内质控物来源：

批号：

扩增位置：

所取理的标本（对应标本接收的唯一编号）及拟扩增位置：1 9 17 2533 41 49…

…2 10 18 2634 42 503 11 19 2735 43 514 12 20 2836 44 525 13 21 2937 45 536 14 22 3038 46547 15 23 31 39 47558 16 24 32 40 4856核酸提取及加样过程：按XXX（列出编号）SOP进行。仪器设备使用：生物安全柜：正常不正常恒温仪温度校准：

℃离心机：正常不正常振荡器：正常不正常实验后：按XXX（将有关SOP编号列出）SOP清洁实验室台面、地面及仪器设备。按XXX（将有关SOP编号列出）SOP处理实验废弃物。操作者：

扩增及产物分析区（3区）

实验前打开通风设备实验台面清洁（水或70%酒精擦拭）实验室温度：

℃（允许范围：10~30℃）；相对湿度：

（允许范围：30%~70%）扩增仪操作：开机自检及运行正常按XXX（列出编号）SOP进行编程、参数设定标准曲线计算值：Slope值:

(-3.3~-3.5)Intercept值:

(＞40)r值:

（）室内质控结果：结果：

□填写室内质控记录、描质控图是否失控：□否□是实验结果：见所附扩增仪打印结果实验后：按XXX（将有关SOP编号列出）SOP清洁实验室台面、地面及仪器设备。按XXX（将有关SOP编号列出）SOP处理实验废弃物。操作者：人员培训培训所涉及的范围:仪器设备使用、维护和校准；试剂、方法原理；质量管理体系；相关法律法规、相关领域的新技术、新理念和新进展；实验操作技能等。如何培训：讲座、讨论、自学和参加培训班等。培训的评估：书面考试、实验考核、讨论心得、论文、综述等。对培训者的评估：培训者的背景、资历、在相关领域内的成就、所接受过的相关领域外部培训情况等。人员培训

方法原理核酸扩增检测的关键环节仪器设备使用、维护和校准结果的分析、报告及进一步处理质控的分析知其然又知其所以然。

实验室内部培训存在的问题

人员少，实际上没有内部培训形式没有年度培训计划没有培训记录

实验室人员内部培训的重要性

外部培训提供的是“理念”，是被动的，更多的是“学习”

内部培训是主动的，源于实践，高于实践，更多的是“思考”

内部培训所涉及的范围

理论

专业

试剂、方法原理质量控制方法相关领域的新技术其他

相关法律法规质量管理体系新理念和新进展操作

仪器设备使用、维护和校准实验操作技能

内部培训的原动力

基本的工作需要

•仪器设备使用、维护和校准•知识更新•基本实验技能……

分析所做的

•工作程序不到位？•仪器设备操作、维护、校准？•人员操作？•质控方法？……

患者或医生投诉

•结果解释错误？•与临床沟通不够？•检测程序、仪器设备有问题？•质控问题？……

室内质控方法

非统计学方法

统计质控方法

非统计学方法

已知弱阳性质控样本（基质与待测标本相同）：至少带1份，其最后的检测结果，应是核酸提取和扩增检测的有效性的综合反映。已知阴性质控样本（基质与待测标本相同）：至少带1份，扩增测定的结果可以判断核酸提取过程中是否发生污染。统计学质量控制理想的室内质控样本的条件测定中质控样本的设置、数量及排列顺序

统计学质控的特点

统计质控方法（检）测室内质控的SOP：耗品质检试剂质检质控方法（纠错措施）质控图室间质评的SOP：纠偏措施室内质控质控目的：假阴性、假阳性，准确性、精密度质控点：样本质量、模板提取、扩增效率质控物安排：空白、阴对、弱阳对、标准品控制范围：空白、阴对-------阴性弱阳对-------阳性（上下一次方）标准品-------r值（二个9）斜率（-3.5----4.0）截距（-40左右）点间CT值（3.3左右）理想的室内质控样本的条件基质与待测样本一致；所含待测物浓度接近试验的决定性水平；稳定；靶值或预期结果已定；无已知的生物传染危险性；单批可大量获得；价廉每次（批）测定质控物的数量及放置标本数量如小于30，弱阳性和阴性质控各1份，标本数量增加，质控物数量相应按比例增加均匀分散于临床标本中，与临床标本一同处理（核酸提取）扩增时的排列顺序，可排于标准品或校准品之后，临床样本之前。但在扩增仪中的位置，不应永久性的固定的在一个孔，而应在每次扩增检测时，进行相应的顺延，以使在一定的时间内，可以尽可能的监测每一个孔的扩增有效性。阴性质控样本的种类阴性原血清样本实验过程中带入的空管仅含扩增反应混合液的管阴性原血清样本的功能监测实验室的以前扩增产物的“污染”由实验操作所致的标本间的交叉污染。具体地说，如强阳性标本气溶胶经加样器所致的污染、强阳性标本经操作者的手所致的污染、使用翻盖离心管核酸提取时在较高温孵育时盖子崩开等扩增反应试剂的污染。核酸提取过程中带入的空管监测核酸提取过程中的实验室“污染”的存在（在整个实验过程中，开口放置于核酸提取的操作台面区域内，最后以水为基质，进行扩增）仅含扩增反应混合液的管监测试剂的“污染”实验室是否发生污染的鉴别可将一个或多个空管打开静置于标本制备区30～60分钟，然后加入扩增反应混合液同时以水替代核酸样本扩增，如为阳性，而上述仅含扩增反应混合液的管为阴性，则说明实验室以前扩增产物的存在。室内质控范围确定步骤1）最佳条件下的测定误差。2）已知值的血清在常规检验条件下的误差。3）未知值的血清在常规检验条件下的误差。4）临床应用的要求。对任何一个试验都应确定一个允许的误差范围，前提是满足临床要求。如允许误差定得过小，在临床上不存在任何意义，但为了符合该规定却要花费很大人力、物力和时间。相反，如果将允许误差定得过大，将使监测系统察觉不到临床上要求检出的误差，失去质控的意义。最佳条件下已知值质控血清变异（optimalconditionsvariance,简称OCV）在本实验室最佳条件下（包括操作者、试剂、仪器等）检测质控血清20次，测得结果计算，求出该组数据的均值和标准差（SD）表示该实验室的最佳工作质量。

常规条件下已知值质控血清变异（routineconditionsvariance,简称RCV）做常规检验的技术人员，在常规检验的条件下，将质控血清放在常规检测样本中，进行20次检验，结果计算同OCV法。一般认为RCV的SD在OCV的SD两倍范围内可以接受。若太大应该查找原因，使其向OCV的SD值靠近。在改进实验室条件后（例如较正加样器，纠正洗板操作，调正温育温度等），重新进行RCV的测定。如果RCV的SD值更小，说明OCV不是最佳条件下测定的，应重新再测OCV。基线测定在临床PCR检验中，进行基线测定，既可使用质控样本扩增后的IU/ml进行统计；也可用其对数值进行。使用实时荧光PCR方法，也可采用质控样本的Ct值来进行质控统计分析。（见P150页）常用质控规则的符号及定义符号定义12S

一个质控测定值超出±2s控制限。13S

一个质控测定值超出±3s控制限。22S

两个连续的质控测定值同时超出+2s或－2s控制限。R4S

同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间的差值超出4s控制限。41S

四个连续的质控测定值同时超出+1s或－1s控制限。7T

七个连续的质控测定值呈现一个向上或向下的趋势变化。10X

十个连续的质控测定值同时处于均值的同一侧。Levey-Jennings质控图方法也称Shewhart质控图，是由美国的Shewhart于1924年首先提出，并用于工业产品的质量控制。二十世纪五十年代初，Levey-Jennings将其引入临床检验的质量控制。经Henry和Segalove的改良，即为目前常用的Levey-Jennings质控图。Levey-Jennings质控图Levey-Jennings质控图

基本的统计学含义稳定条件下，在20个IQC结果中不应有多于1个结果超过2SD（95.5%可信限）限度；在1000个测定结果中超过3SD（99.7%可信限）的结果不多于3个。如以±3s为失控限，假失控的概率为0.3%。“即刻法”质控方法“即刻法”质控方法的实质是一种统计学方法，即Grubs异常值取舍法；只要有3个以上的数据即可决定是否有异常值的存在。室内质控数据的评价IQC为一集体活动，除实际测定者外，还应有另外一人对测定数据进行质检。不能将IQC作为一个监察方法，当发现一次测定未达到质量标准时，应以建设性的而非批评的方式去探查失控的原因。除了将IQC数据作为日常质控外，还应定期评价累积数据以监测在测定操作中的长期变化趋势。评价应定期进行。失控情况处理及原因分析填写失控报告单上报实验室负责人，由负责人作出是否发报告的决定分析失控原因重做同一质控物（人为差错、偶然误差）↓新开一瓶质控物（质控物使用、保管）↓新开另一批号质控物（质控物使用、保管）↓重新校准（校准错误）↓进行仪器维护，更换试剂（仪器、试剂）↓请专家帮助完成失控报告单质量审核型式检查（编号唯一性、项目完整性、书写完整性）仪器检查（状态、校准）试剂检查（效期）质控检查（室内、室间）异常值检查（及时与临床联系）弱阳性质控样本常见的失控原因核酸提取中的随机误差:如核酸提取中的丢失、有机溶剂的去除不彻底、标本中扩增抑制物的残留等。仪器的问题:如扩增仪孔间温度的不均一性、孔内温度与所示温度的不一致性等。试剂的问题:如Taq酶和/或逆转录酶的失活、探针的纯度及标记效率和核酸提取试剂的效率等。

室内质控的局限性IQC可确保每次测定与确定的质量标准一致，但不能保证在单个的测定样本中不出现误差。比如样本鉴别错误、样本吸取错误、结果记录错误等。此类误差的发生率在不同的实验室有所不同，一般要求小于0.1%，且应均匀地分布于测定前、测定中和测定后的不同阶段。影响临床基因扩增检验结果的

最关键因素产物“污染”（Carry-over)测定人员的操作：标本混淆；贴错标签、核酸提取等试剂避免基因扩增检验假阳性结果的措施严格的实验室分区；使用带“滤心”的吸头；设立“阴性”质控（与标本同时处理）；使用防“污染”（含UNG）的PCR试剂；临床“假阳性”问题：病原微生物如结核杆菌经药物治疗后已死亡，但PCR仍可为阳性，故治疗结束后至少两周内不宜做PCR检测。避免基因扩增检验假阴性结果的措施避免由于来自于标本的血红蛋白、肝素、某些激素或来自标本处理中的去垢剂、有机溶剂的抑制作用的措施：纯化核酸；标本重复双份测定；稀释标本。使用“内质控”（InternalControl,IC)以避免由于试剂、扩增仪或标本处理不当所致的假阴性；须注意的是，如果靶浓度很高，可致在靶核酸和IC之间产生竞争，而使IC受抑制，此时IC可为阴性。核酸检测国际标准项目研制者发布年编号浓度HBVDNANIBSC199997/746106IU/mlHCVRNANIBSC199796/790105IU/mlNIBSC200596/798105IU/mlHIV-1RNANIBSC199897/656105IU/瓶HAVRNANIBSC200300/560105IU/mlB19DNANIBSC200099/800106IU/ml病毒核酸检测国家标准

项目研制者发布年编号浓度HBVDNANCCL2005GBW(E)0900311.03106IU/mlNCCL2007GBW09151HCVRNANCCL2005GBW(E)0900321.29105IU/mlNCCL2007GBW09152病原体核酸质控物HBVDNA液体质控物（单位：IU/ml)编号 靶值（对数值） 范围HBVDNAS1 5.42×106(6.73) 1.70×106～1.70×107(6.23～7.23)HBVDNAS2 3.19×106(6.50) 1.00×106～1.00×107(6.00～7.00)HBVDNAS3 9.42×105(5.97) 2.95×105～2.95×106(5.47～6.47)HBVDNAS4 2.60×105(5.41) 8.13×104～8.13×105(4.19～5.91)HBVDNAS5 7.66×104(4.88) 2.40×104～2.40×105(4.38～5.38)该质控品为液体血清，每支500l，使用时室温放置15分钟使其充分复融，颠倒或漩涡振荡并瞬时离心后使用。病原体核酸质控物HCVRNA冻干质控物（单位：IU/ml)编号 靶值（对数值） 范围0711 1.32×106(6.12) 4.17×105～1.70×106(5.62～6.62)0712 1.05×106(6.02) 3.31×105～3.31×106(5.52～6.52)0713 5.76×105(5.76) 1.82×105～1.82×106(5.26～6.26)0715 6.61×103(3.82) 2.09×103～2.09×104(3.32～4.32)0716 8.72×104(4.94) 2.75×104～2.75×105(4.44～5.44)该质控品为冻干血清，每支300l，使用时用DEPC水复溶，室温放置5分钟，漩涡振荡使之充分溶解并混匀，瞬时离心后使用。使用注意事项

该质控品是具有生物活性的样品并具有传染性，请使用务必按传染性样品对待。实验室收到血清后应将血清保存在–18℃以下，保质期为1年。定性测定：一份弱阳性（接近测定下限）和一份阴性质控(依样本数量而定）。定量测定：高、中、低三种浓度的质控样本。工作程序的标准化标本采集程序的标准化仪器设备的校准、维护和正确使用试剂和消耗品的质检防“污染”措施的实施人员的培训上岗严格的室内质量控制参加室间质量评价结果报告和解释的标准化工作规范的制订室间质量评价（EQA）IQC确保实验室室内测定质量的一致性，而EQA则提供将实验室测定情况与室间和客观标准进行回顾性比较的数据。EQA在质量保证中对IQC有一补充作用。EQA的程序设计确定质评方案,定期发放质评样本；要求参加质评实验室报告结果的单位要一致，以便于统