临床免疫学检验：5 免疫荧光技术

免疫标记技术

用可以微量检测的标记物（示踪物质）标记抗原或抗体，作为试剂，与相应抗体或抗原结合反应后，测定抗原抗体复合物中的标记物，从而推断所测抗体或抗原有无及量的多少。免疫标记技术

=抗原抗体反应示踪物标记灵敏性特异性免疫标记技术的主要特点：高特异性、高灵敏性免疫技术+标记技术酶荧光素同位素常用标记物

荧光素酶同位素胶体金可发光化学物质试验命名：

根据标记物命名如：免疫荧光技术免疫酶技术等第七章荧光免疫技术（fluoroimmunoassay)（P61)

原理：用荧光素标记抗原或抗体，与待测标本中相应抗体或抗原结合，通过检测荧光，确定标本中有无待测的抗体或抗原。特点：特异性、敏感性、直观性荧光免疫技术分类：免疫荧光显微技术（定性、定位）免疫荧光测定技术---荧光免疫分析（定量）一.荧光、荧光素及荧光显微镜（一）荧光

一种光照射某种物质时，该物质由基态跃迁到激发态，当回复至基态时，可发射出比照射光波长更长的光，称为荧光。照射光:可见光、紫外光(二）荧光素

能产生荧光的物质，可作为染料。

常用荧光素：1.异硫氰酸荧光黄(FITC)

可发出黄绿色荧光2.四乙基罗丹明（RB200)

发出橘红色荧光3.藻红蛋白（PE）

发出橙色荧光4.镧系螯合物：铕（Eu3+)、铋(Tb3+)、铈(Ce3+)等螯合物。荧光衰变时间长，适合时间分辨荧光免疫测定（三）荧光显微镜

1.结构：主要组成

A.白炽光源（超高压汞灯）：发射紫外光或兰紫光；

B.两组滤光板:激发滤板（选择合适的激发光谱）；抑制滤板（抑制紫外光或兰紫光进入视野，只允许荧光通过。

C.显微镜：普通的光学显微镜。

光路程序：白炽光源——发射紫外光or兰紫光——激发滤板——紫外光

——被检物（荧光染色标本）——紫外光＋荧光

——抑制滤板——荧光（显微镜下可见）目镜阻挡滤镜载玻片荧光显微镜光路示意图光源隔热滤片激发滤片聚光器物镜荧光显微镜光路示意图荧光显微镜据光源路径分

透射式（光源从下面经聚光器会聚后到达样品，适用于观察对光可透的标本）落射式（光源从上面到达样品，经标本反射进入物镜。适用于观察透明度不好的标本及各种活性组织等）2.使用注意事项：染色后立即检查（荧光易猝灭）准备好后开启白炽光源，不能随时启灭。打开后15分钟才能关闭每次使用2小时保持室内通风

荧光素可以标记（染色）抗原，也可以标记抗体标记抗原用得少标记抗体用得多

一般免疫荧光显微技术均标记抗体二.免疫荧光显微技术（一）荧光抗体的制备（二）片子的制作（三）荧光抗体染色方法（一）荧光抗体的制备：

纯化的一定量抗体加一定量FITC(搅拌使结合）去除游离荧光素测抗体效价、测荧光素与蛋白质（Ab）结合比（F/P）

小量分装保存备用F/P是评价荧光抗体的重要指标。活细胞染色：F/P=2.4

固定标本染色：F/P=1.5

抗体效价：＞1：16（二）片子的制作：1.常做切片（组织）、涂片（细菌）、印片（细胞），要求薄、均匀，并与玻片充分固定。固定后不能被洗脱。2.注意保持抗原完整性3.不同材料固定方法不同（无水已醇、丙醇、聚甲醛等）（三）荧光抗体染色法

1.直接法

待测标本固定（Ag？）+Ab

快、直接、干扰因素少用于检测抗原每检测一种抗原需标记相应的荧光抗体,较麻烦洗涤，AgAb2.间接法

分两步：第一步：荧光素标记抗抗体（如荧光标记的羊抗人IgG）；

第二步：已知Ag固定＋待测标本（Ab？）——洗涤，＋荧光标记的抗抗体——洗涤，荧光显微镜镜检

间接法用得最多优点：制备一种荧光标记二抗（抗抗体）可用于多种Ab检测灵敏度高3.补体法：第一步：荧光素标记抗补体；第二步：已知Ag固定＋待测标本（Ab？）＋补体——洗涤，＋荧光标记的抗补体——洗涤，荧光显微镜镜检特点：

灵敏度高，制备一种荧光抗补体用于多

种检测

干扰因素多，补体不稳定，易失活，该法少用4.双标记法

用两种荧光素（FITC、罗丹明）分别标记针对同一Ag上不同抗原表位的抗体，对同一标本染色，当Ag有两种相应抗原表位存在时，可同时见到黄绿和橙红两种荧光。（四）免疫荧光显微技术优缺点优点：

1.特异性、敏感性高

2.快速

3.可定位

4.既可测Ag（各种病原体、肿瘤相关抗原）、可测Ab（自身抗体）缺点：1.需要荧光显微镜2.存在非特异荧光干扰（产生原因：自发、抗体不纯、交叉反应、技术问题）3.定性测定、判断结果不客观4.制备的片子难以长期保存（荧光猝灭）4.免疫荧光显微技术的优缺点5.荧光显微镜的光源分几种？三.荧光免疫分析时间分辨荧光免疫测定---液相检测原理：用铕(Eu3+)等具有较长荧光寿命的稀土金属作荧光标记物来标记Ab或Ag，从而检测待测标本中相应Ag或