实验四产物的载体克隆和转化

实验四产物的载体克隆和转化第一页，共三十六页，2022年，8月28日重组DNA技术操作步骤第二页，共三十六页，2022年，8月28日基本原理目的基因的获取DNA导入受体细胞外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

第三页，共三十六页，2022年，8月28日主要步骤：①制备目的基因和选择相关载体②目的基因和有关载体进行连接③重组的DNA导入受体细胞④DNA重组体的筛选和鉴定⑤DNA重组体的扩增、表达和其他研究第四页，共三十六页，2022年，8月28日

以质粒为载体的DNA

克隆过程第五页，共三十六页，2022年，8月28日

（三）PCR扩增特定基因

（四）人工合成一、目的基因的获得——分

（一）从基因组文库中获得

（二）从cDNA文库中获得第六页，共三十六页，2022年，8月28日组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合从基因组DNA文库获取目的基因第七页，共三十六页，2022年，8月28日限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库第八页，共三十六页，2022年，8月28日mRNAcDNA

双链cDNA重组DNA分子cDNA文库

反转录酶载体受体菌复制

从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT第九页，共三十六页，2022年，8月28日化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。第十页，共三十六页，2022年，8月28日几种常用克隆载体的比较注：+表示可用；-表示不可用比较内容质粒λ噬菌体黏性质粒M13噬菌体克隆容量<10kb<22kb40～50kb<1kb基因组DNA文库-++-cDNA文库++--亚克隆+--+序列分析++-+E.coli表达++--二、载体的选择与准备——选第十一页，共三十六页，2022年，8月28日三、DNA分子的体外连接——接（一）黏性末端（二）人工接头的使用（三）加入同聚体尾（四）平端连接第十二页，共三十六页，2022年，8月28日（一）黏性末端第十三页，共三十六页，2022年，8月28日（二）人工接头第十四页，共三十六页，2022年，8月28日（三）加入同聚体尾待克隆DNA片段重组质粒混合、退火空白质粒第十五页，共三十六页，2022年，8月28日（四）平端连接第十六页，共三十六页，2022年，8月28日5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´5´

3´3´5´3´A(A)nA

A(A)nA

λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体5´3´5´第十七页，共三十六页，2022年，8月28日四、外源DNA导入宿主细胞——转受体菌条件：安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)

导入方式：转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)第十八页，共三十六页，2022年，8月28日

外源基因导入宿主细胞后，筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。五、目的基因的筛选和鉴定——筛第十九页，共三十六页，2022年，8月28日1.借助载体上的遗传标志进行筛选

(1)利用抗生素抗性标志筛选(2)利用基因的插入失活/插入表达特性筛选(3)利用标志补救筛选(4)利用噬菌体的包装特性进行筛选2.序列特异性筛选

(1)RE酶切法(2)PCR法(3)核酸杂交法(4)DNA测序法

第二十页，共三十六页，2022年，8月28日（一）

遗传学方法1.插入灭活法第二十一页，共三十六页，2022年，8月28日插入失活筛选带有重组载体的克隆第二十二页，共三十六页，2022年，8月28日第二十三页，共三十六页，2022年，8月28日2.蓝-白筛选（α互补）

许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端145个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有活性的β-半乳糖苷酶，使人工底物X-gal转化成蓝色的代谢产物，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lacZ基因灭活，不能生成有活性的β-半乳糖苷酶，结果菌落呈现白色。第二十四页，共三十六页，2022年，8月28日α互补筛选（蓝-白筛选）第二十五页，共三十六页，2022年，8月28日第二十六页，共三十六页，2022年，8月28日PCR产物的T载体

克隆和转化

第二十七页，共三十六页，2022年，8月28日实验目的：

学习T载体的特点和PCR产物的克隆方法。实验要求：

掌握利用T载体克隆PCR产物的方法；复习连接实验流程。技术应用：

目的基因片段与T载体DNA连接，达到克隆基因的目的。第二十八页，共三十六页，2022年，8月28日材料：目的基因片段（回收的PCR产物）药品：pEMGT-Vector(Promega公司)第二十九页，共三十六页，2022年，8月28日

质粒（plasmid）是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA

分子。大小约为数千碱基对。常有1~3个抗药性基因，以利于筛选。第三十页，共三十六页，2022年，8月28日质粒载体克隆的质粒载体允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA水平上的操作。基因表达的质粒载体

允许外源DNA的插入、储存和表达。第三十一页，共三十六页，2022年，8月28日第三十二页，共三十六页，2022年，8月28日实验原理普通Taq酶会在3´末端加一个A，这样所有PCR产物都会在双链DNA的3´端均有一个单链状态的A；T-载体是线状DNA片段，在DNA双链的3´端均有一个单链状态的T；二者在连接酶的作