实验七聚合酶链式反应多态性

实验七聚合酶链式反应多态性第一页，共二十一页，2022年，8月28日一、实验目的和要求通过本实验学习和掌握PCR基因扩增的原理和操作方法，并深刻理解PCR基因扩增技术在DNA操作中的重要性。

第二页，共二十一页，2022年，8月28日

PCR用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。每个循环包个三个步骤，即，首先加热到94

-95℃使模板DNA变性,接着将反应液冷却到某一温度,使引物与它的靶序列发生退火,此后,退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。如此反复进行变性、退火和延伸这一循环。由于一轮扩增产物又充当下一轮扩增的模板，所以每完成一个循环，就使目的DNA产物增加一倍。二、实验原理第三页，共二十一页，2022年，8月28日第四页，共二十一页，2022年，8月28日PCR反应系统的组成PCR反应系统的组成主要包括：模板DNA、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶、缓冲液。第五页，共二十一页，2022年，8月28日

要扩增模板DNA，首先要设计两条引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。由于引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键，因此，引物设计也就更为重要。引

物：第六页，共二十一页，2022年，8月28日

引物在PCR反应中的浓度一般在0.1～1μM之间。浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率。第七页，共二十一页，2022年，8月28日dNTP（dATP,dTTP,dCTP,dGTP）在PCR反体系中dNTP终浓度高于50mM会抑制Taq酶的活性，使用低浓度dNTP可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。PCR常用的浓度为50～200μM，不能低于10～15μM。四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。第八页，共二十一页，2022年，8月28日TaqDNA聚合酶:TaqDNA聚合酶最早是从嗜热水生菌中提纯出来的。典型PCR反应混合物中，常用范围为1～4U/100μl。由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它条件的差异，TaqDNA聚合酶的用量亦有差异，酶量过多会导致非特异产物的增加。第九页，共二十一页，2022年，8月28日模板模板的种类：单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA对于模板的用量:

基因组DNA：50-100ng质粒DNA:5-10ng第十页，共二十一页，2022年，8月28日PCR缓冲液:

用于PCR的标准缓冲液为10～50mM的Tris–HCl缓冲液（pH8.3）和1.5mMMgCl2。第十一页，共二十一页，2022年，8月28日PCR循环次数常规PCR循环次数一般为25～40个周期。一般是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。第十二页，共二十一页，2022年，8月28日PCR扩增过程

在微量离心管中加入适量缓冲液、微量模板DNA、四种脱氧单核苷酸（dNTP）和耐热Taq聚合酶及两个合成DNA引物，并有Mg2+存在。第十三页，共二十一页，2022年，8月28日(1)变性阶段加热使模板DNA在高温下（90℃-95）变性，双链解链；(2)退火阶段降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链；(3)延伸阶段溶液反应温度升至中温(72℃)，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链。第十四页，共二十一页，2022年，8月28日三.实验仪器及材料PCR仪、台式离心机、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统等TaKaRaTaq(5U/l)10×PCRBuffer(Mg2+Plus)dNTPMixture(each2.5mM)模板DNA引物（10M)第十五页，共二十一页，2022年，8月28日1、设计PCR反应程序

94℃预变性5min94℃1min55℃1min45cycles72℃2min72℃10min4℃冷却恒定。四、实验步骤第十六页，共二十一页，2022年，8月28日2、在0.2ml薄壁管中，依次加入以下各成分:ddH2O:

12.5l

10×buffer（Mg2+）:2ldNTPs(2.5mM)

2l

primer(10M)

:2lTaqDNApolymerase(5U/l)

:0.5l

DNA(10ng/l):1l总体积20l第十七页，共二十一页，2022年，8月28日3、混匀后，离心2-3秒，将PCR薄壁管放入PCR仪的样品槽中，按START键，启动PCR仪。第十八页，共二十一页，2022年，8月28日采