第四章-酶的提取与分离纯化

第四章酶的提取与分离纯化预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞破碎（分离胞内产物）等。初步纯化（roughfractionation）（提取）：除去与目的产物性质差异很大的杂质。高度纯化（finefractionation）（精制）：除去与产物性质相似的杂质。浓缩与干燥（concentrationanddesiccation）（成品加工）:使酶与溶剂分离的过程。酶纯化的基本原则：①建立一个方便灵敏的分析方法；②选择有效的纯化方法，尽可能减少纯化步骤；③常在低温（4℃）条件下进行纯化，以避免酶的变性。第一节细胞破碎

（一）细胞壁组成

微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌放线菌酵母菌霉菌壁厚/nm15~5010~13同G+100~300100~250层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖(40%~90%)多糖胞壁酸蛋白质脂多糖(1%〜2%)肽聚糖(5%~10%)脂蛋白脂多糖(11%~22%)磷脂蛋白质葡聚糖(30%~40%)甘露聚糖(30%)几丁质(1%~2%)蛋白质(6%~8%)脂类(8.5%~13.5%)多聚糖(80%~90%)脂类蛋白质各种微生物细胞壁的结构与组成

细菌细胞壁的结构

酵母菌细胞壁的结构

M—甘露聚糖；P—磷酸二酯键；G—葡聚糖

（二）细胞破碎的方法

机械法:搅拌;研磨物理法：渗透压或温度突变化学法：化学试剂改变细胞膜结构生物法（酶解）：外加酶法或自溶法第二节酶的提取(extraction)

把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。

提取原则a.相似相溶。b.远离等电点的pH值，溶解度增加。提取方法：（一）盐溶液提取

常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），对酶稳定性好、溶解度大，最常用。

（二）酸、碱溶液提取（三）有机溶剂提取第三节沉淀分离（根据溶解度的不同）使溶液中的溶质由液相转变为固相析出古老、实用、简单的初步分离方法在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：

⑴中性盐沉淀（盐析法）

⑵有机溶剂沉淀⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性）⑷等电点沉淀⑸复合沉淀法（一）盐析沉淀法（改变离子强度）1.基本原理（盐溶和盐析）

向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象：

1)盐溶（saltingin）：低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。

2)盐析（saltingout）：高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。蛋白质的盐析硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响离子强度盐析盐溶

原因：高盐：①与蛋白质分子争夺水②中和电荷不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。1）中性盐的选择常用（NH4）2SO4

2.盐析用盐2)调整盐浓度的方式

a.饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又不太高时。

b.添加固体硫酸铵适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高时。实际使用时，可直接查表（各种饱和度下需加固体硫酸铵的量）。调整硫酸铵溶液饱和度计算表盐析操作低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般终饱和度不超过40％。高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。1）固体硫酸铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。2）冰箱中（4℃）放置过夜，待沉淀完全后高速离心。3）沉淀再溶解后可用超滤（ultrafiltration）、透析（dialysis）或层析（chromatography）方法脱盐。3.离子强度和种类（介绍盐析常数）蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：I：离子强度S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L）S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L）Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐有关的特性常数。Ks代表盐析效率，其含义是随着盐浓度的增加，蛋白质溶解度降低的速度，Ks越大盐析效果越好。

当温度和pH一定时，S0对于某一溶质是常数，用β表示，盐析方程式可改写为：

logS=β-KsI

两种盐析法：Ks分段盐析法：在一定的pH和温度条件下，通过改变离子强度或盐浓度（即改变I值）使不同酶先后沉淀的方法。β分段盐析法：在一定盐和离子强度下，通过改变溶液的pH及温度的沉淀方法。（二）有机溶剂沉淀（降低介电常数）

利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。1.沉淀机理

降低溶液的介电常数部分地引起蛋白质脱水2.常用有机溶剂乙醇、丙酮、甲醇，用量一般为酶液体积的2倍左右，终浓度为70%。

3.优缺点：

优点：1）分辨率比盐析法高

2）沉淀不需脱盐3）溶剂易蒸发，沉淀易离心缺点：1）容易引起蛋白质变性失活2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。

（三）等电点沉淀(isoelectricprecipitation)

1.原理蛋白质在等电点时溶解度最低不同的蛋白质具有不同的等电点

2.使用方法单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用（如盐析法、有机溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度。（四）复合沉淀法

1.作用机理：与有机溶剂类似，是发展较快的一种新方法。2.沉淀剂：常用聚乙二醇（Polyethyeneglycol，简写PEG多用分子量为6000～20000的PEG）、单宁等（五）选择性变性沉淀法选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。

⑴热变性

⑵pH变性

⑶有机溶剂变性

举例：牛红细胞提取Cu，Zn－SOD的生产工艺：新鲜牛血收集除血浆离心红细胞浮选2％NaCl干净红细胞溶血溶血液去血红蛋白乙醇、氯仿上清分级沉淀丙酮沉淀物热变性SOD粗酶液超滤浓缩液柱层析精制浓缩液冷冻干燥冻干粉70℃DEAE－sephadexA50第四节离心分离一基本原理1.离心力

Fc＝mr

ω2＝mr（2N/60）2

N为离心机每分钟转数（r/min）；Fc通常以相对离心力RCF（relativecentrifugalforce）表示，即离心力F的大小相当于地球引力（重力常数g）的多少倍。一般用g（或数字g）表示。RCF=mr（2N/60）2/mg=1.1210-5N2r

此公式描述了相对离心力与转速之间的关系通常：低速离心以每分钟的转数表示，如：4000r/min。高速离心（超速），常以相对离心力（RCF）表示，如：65000g。两者可换算或查测算图。（直线法）

计算近似RCF的列线图二离心机的种类按离心机转速的不同，分为：常速（低速）高速超速

名称

转速(r/min)

注意事项

低速离心机

8000常温，注意样品热变性和离心管平衡

高速离心机

8000〜25000冷冻（防止温度升高），离心管的精确平衡

超速离心机

>25000冷冻＋真空系统（减少空气阻力和摩擦），离心管的精确平衡

离心机的种类

实验室离心机温度类型：常温及冷冻超速离心机均为冷冻型。使用冷冻离心机时提前降温，预冷离心头。使用超速离心机时先抽真空。离心的形式角式及外摆式：外摆式一般为低速，角式由低速到超速均有。角式离心机和离心头（转子）角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖、旋紧。离心机的大小：落地式及台式小台式离心机离心管材质：玻璃，塑料强度：和离心速度相配大小：和转子配套高速超速管要加盖离心机操作平衡、定温、定速、定时。三常用离心方法

差速离心法密度梯度离心等密度梯度离心1．差速离心

（differentialcentrifugation）

采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。

优点：操作简单。缺点：1）分离效果较差，不能一次得到纯颗粒。2）沉降的颗粒受到挤压。

差速离心分离示意图

（a）离心前的悬浮液（b）～（e）离心不同时间后颗粒的沉降情况

2．密度梯度离心

（densitygradientcentrifugation）

样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。

常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液。特点：区带内的液相介质密度小于样品物质颗粒的密度。

密度梯度离心示意图

（a）离心前（b）离心后

Densitygradientultracentrifugation密度梯度离心

步骤：A.形成密度梯度B.加样C.离心D.收集样品3.等密度梯度离心

又称沉降平衡离心（sedimentationequilibriumcentrifugation）。根据颗粒的密度不同而进行分离。离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成区带。常用氯化铯（CsCl）作为梯度介质。特点：

介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。

等密度梯度离心示意图

（a）离心前；（b）离心后

四应用根据不同离心目的，分为制备性离心：分离纯化和制备分析性离心：

测分子量、沉降系数、密度、纯度（生化上P294）

第五节过滤与膜分离过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状物质分离的技术过程。

非膜过滤：粗滤，部分微滤膜过滤：高分子膜介质一、非膜过滤

高分子膜以外的材料：滤纸，滤布，纤维，多孔陶瓷，烧结金属等1.粗滤（通常所说的过滤）截留直径大于2μm的大颗粒，使固液分开。根据推动力的产生条件不同，过滤分为三种：常压过滤

加压过滤

减压过滤2.非膜微滤：微孔陶瓷，烧结金属作介质二、膜分离

借助一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、形状、性质的颗粒或分子进行分离的技术。（一）扩散膜分离——透析（dialysis）溶质分子Y从高浓度一侧通过膜向低浓度一侧移动蛋白质透析

1.透析膜

商品透析膜大多制成管(袋）状。材料：纤维素衍生物。1）透析膜的预处理：目的：除杂质。

2）透析袋的保存：防腐剂＋冷藏。透析袋在使用前最好在EDTA-NaHCO3溶液中煮过，以除去生产过程中混入的有害物质，特别还应检查一下有无破损、泄漏处，这样才能装入待透析液，两头扎紧，进行透析。一般透析液需更换3—5次。透析袋使用完后，一般可用清水冲洗干净，再次检查是否完好，然后浸入75％乙醇溶液中保存备用（冰箱）。2.透析方法及装置

透析袋透析简单装置。A:透析夹，B:透析，C:透析示意图

3.用途蛋白纯化中，除去无机盐等小分子物质。

缺点：透析时间较长，透析后体积较大，浓度较低，难于工业化生产。（二）加压膜分离

根据所截留物质颗粒大小的不同，分为：截留颗粒直径操作压力应用微滤0.2~2m<0.1MPa除菌超滤0.002~0.2m0.1~0.7MPa分离病毒及生物大分子反渗透<0.002m0.7~13MPa纯水制备利用超滤膜在一定压力下使溶液中大分子滞留，而小分子及溶剂滤过的方法。超滤法在蛋白质溶液除盐、浓缩及分离纯化中有广泛的应用。超滤(ultrafiltration，UF)反渗透（Reverseosmosis，RO）

利用反渗透膜选择性地只能透过溶剂(通常是水)的性质，对溶液施加压力，使溶剂通过反渗透膜而从溶液中分离出来的过程。（无离子水制备；海水淡化）渗透与反渗透（三）电场膜分离电渗析：在半透膜的两侧分别装上正、负电极。应用：脱盐，海水淡化，纯水制备，从发酵液中分离柠檬酸、谷氨酸等带有电荷的发酵产物。第六节层析法层析法也称色谱法，是1903年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。将植物色素溶液通过装有CaCO3吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。色谱起源色谱组分色素石油醚碳酸钙颗粒用色彩（chroma）和图谱（graphs）组成色谱一词（Chromatography)。一、层析法的基本原理

利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移动而达到分离的目的。mobilephase：携带样品流过整个系统的流体

stationaryphase：静止不动的一相

按层析过程的机理分类：吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异。分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的不同。离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。亲和层析：利用生物分子与配基之间专一而又可逆的亲和力。层析聚焦：将酶的等电点特性和离子交换特性结合在一起。二、层析法的分类按操作形式不同分类：柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。三、层析设备层析装置：梯度混和器蠕动泵层析柱监测仪记录仪收集器

记录仪低温层析柜四、层析操作分离前：1）树脂预处理：凝胶溶涨。离子交换纤维素需作酸碱处理。2）装柱：重力沉降法，要求均匀，无气泡。3）平衡：层析柱使用前，须用缓冲液平衡至所需的pH值和离子强度。层析操作分离中：上样：体积尽可能小。平衡：用缓冲液使不被吸附的杂蛋白穿过。洗脱：连续梯度洗脱：连续改变缓冲液的pH或离子强度。阶梯式梯度洗脱：分段地改变缓冲液的pH或离子强度。同时进行分步收集和检测。

分离后：再生，平衡，保存。蛋白质定量-——分光比色仪(A280)法蛋白质分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基（主要是色氨酸Trp和酪氨酸Tyr的共轭双键）对紫外光有吸收，以色氨酸吸收最强，最大吸收峰为280nm。在波长280nm具有吸光的氨基酸紫外吸收法平衡、吸附盐梯度冲洗分管收集蛋白测定制图测A280（一）吸附层析（adsorptionchromatography）1.原理

利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差异进行分离。五、常用方法吸附作用的强弱主要与吸附剂和被吸附物质的性质有关。吸附层析的关键是吸附剂和洗脱剂的选择。2.洗脱方法

溶剂洗脱法置换洗脱法前缘洗脱法3.吸附剂

吸附剂通过范德华力、静电引力、疏水作用等与待分离物质的极性官能团作用。根据吸附能力强弱分为：弱吸附剂：蔗糖、淀粉中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙[Ca10(PO4)6.(OH)2]

、硅胶(极性)等强吸附剂：氧化铝、活性炭(常用)吸附剂的选择根据相似相溶原则：极性强的吸附剂易吸附极性强的物质非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。但为了便于解吸附，对于极性强的物质通常选用极性弱的吸附剂进行吸附。

4.洗脱剂要求：

粘度小，纯度高，稳定性好，完全洗脱下所要分离的成分,易与目标分子分离。选择：

具有较高洗脱能力的洗脱剂作为流动相(相似相溶)常用：不饱和烃、醇、醚、水、中性盐生物大分子一般选择中性盐溶液为洗脱剂。5.应用

分离纯化生物大分子（二）凝胶过滤层析

凝胶过滤（gelfiltration）又称分子筛层析（molecularsievechromatography）、排阻层析（exclusionchromatography）,是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行分离的技术。1.基本原理

大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。按分子量由大→小顺序流出层析柱。凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数Kd表示：

Ve-VoKd=————ViVo——外水体积，层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积（ml）Vi——内水体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和（ml）Ve——某组分的洗脱体积，从加进层析柱到流出液中该组分出现高峰时的洗脱液体积（ml）凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰Ⅰ.Kd=0时,即Ve=Vo,说明该组分分子量足够大，不进入微孔，最先流出。Ⅱ.Kd=1时,即Ve=Vo+Vi，说明该组分能进入凝胶的全部内空隙，最后流出。Ⅲ.其它组分0<Kd<1,因分子大小而改变洗脱峰的位置。Kd小的先流出，Kd大的后流出。分配系数Kd的意义：1)可定量地衡量各组分的流出顺序。2)判断分离效果，Kd差异大，分离效果好，Kd差异小，分离效果差。2.凝胶的种类和性质

1)交联葡聚糖凝胶商品名:Sephadex型号

SephadexG－10至G-200G后的数字为凝胶吸水值的10倍。数字越大，交联度越小，孔径越大，分离范围越广。凝胶型号

颗粒大小/μm

溶胀体积/(ml/g)

分离范围（Mr）

SephadexG-10

SephadexG-15

SephadexG-25

SephadexG-50

SephadexG-75

SephadexG-100

SephadexG-150SephadexG-2004～120

4～120

50～150

50～150

40～120

40～120

40～120

40～120

2～3

2.5～3.5

4～6

9～11

12～15

15～20

20～30

20～30

小于7×102

小于1.5×103

1.0×103～5.0×103

1.5×103～3.0×1043.0×103～8.0×104

4.0×103～1.0×105

5.0×103～3.0×105

5.0×103～6.0×105

葡聚糖凝胶层析介质的有关参数

2）琼脂糖凝胶

商品名:Sepharose（瑞典）;Bio-GelA(美国）依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。型号

使用范围（蛋白质的分子量）含琼脂糖（℅）

6BSepharose4B2B104～3×106105～3×107106～108

642

6BSepharoseCL4B2B

同上

同上

0.5m

Bio-GelA1.5m5m15m50m150m10～500×10310～150010～500040～15000100～500001000～150000

1086421

Sepharose及Bio-gelA型号

3）聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel）

商品名为Bio-Gel,型号从Bio-GelP－2至P-300，P值越大，孔径也越大。以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯酰胺为交联剂聚合成的高分子聚合物。3.操作：1）凝胶的选择和处理根据相对分子质量范围选择相应型号的凝胶介质。将干胶悬浮于5~10倍的蒸馏水中，充分溶胀，抽气，装柱。2）柱的选择采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影响流速。3）加样体积不能过多，不超过床体积的5％，脱盐时可在10％左右。4）洗脱洗脱液与平衡时用的buffer一致。洗速不可过快，保持恒速。5）胶的保存洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态，不必再生处理。用0.02%NaN3防腐。4.应用1）脱盐２)生物大分子物质的分离纯化3）分子量的测定

LogMABCLogM测V测LogM=k1-k2Ve（Ve为洗脱体积）先测得几种标准蛋白质的Ve，并以其分子量对数对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，查标准曲线即可确定分子量。蛋白质的洗脱体积与其分子量有关（三）离子交换层析

（ionexchangechromatography，IEC）1.原理:利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同而达到分离的纯化方法。1）离子交换剂：离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。

如羧甲基纤维素离子交换剂组成纤维素—O—CH2—COO-—H+

载体电荷基团反离子

化学原料合成：树脂类物质载体

天然材料制成：cellulose

sephadexsepharose

阳离子交换剂:电荷基团（－）,反离子（＋）活性基团阴离子交换剂:电荷基团（＋）,反离子（－）

如：DEAE-纤维素，CM-Sepharose离子交换剂--带有电荷基团的不溶性载体-O-CH2CH2N-HCH2CH3CH2CH3Cl-载体Diethylaminoethyl(DEAE)阴离子交换剂(可吸附带负电的蛋白质)阳离子交换剂(可吸附带正电的蛋白质)两种离子交换剂阳离子交换剂：常用羧甲基（弱酸）

CM—CH2COO－

磺丙基（强酸）

SP—C3H6SO3－阴离子交换剂：常用二乙氨基乙基（弱碱），季胺乙基（强碱）

DEAE－C2H4N+(C2H5)2HQAE－C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3

离子交换葡聚糖

以SephadexG-25,G-50为骨架，接入离子交换基团。

DEAE（QAE）SephadexA-25，A-50CM（SP）SephadexC-25，C-50

A：anion阴离子

C:cation

阳离子类型说明功能基反离子DEAE-SephadexA-25，A-50弱碱性阴离子交换剂二乙氨基己基氯QAE-SephadexA-25，A-50强碱性阴离子交换剂二乙氨基己基——2-羟丙基氯CM-SephadexC-25，C-50弱酸性阳离子交换剂羧甲基钠SP-SephadexC-25，C-50强酸性阳离子交换剂磺丙基钠离子交换葡聚糖

离子交换剂的选择a.强、弱离子交换剂的选择：强型：适用的pH范围广，制备无离子水

弱型：适用的pH范围窄，分离生物大分子物质

b.阴、阳离子交换剂的选择：若溶液pH<pI，蛋白质带正电荷，用阳离子交换剂若溶液pH

>pI，蛋白质带负电荷，用阴离子交换剂2）蛋白质的电荷性质2.阴离子交换剂分离蛋白质的过程平衡吸附去吸附分离结束再生+低盐高盐利用不同盐浓度将不同蛋白质洗脱下来Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-3.操作离子交换剂的预处理装柱平衡上样平衡洗脱收集再生1）上样：上样体积不十分严格。2）洗脱:增加溶液的离子强度

梯度洗脱法

改变溶液的pH值

3）再生：用0.5mol/LNaOH或0.5mol/LHCl处理。4.应用分离纯化生物大分子（四）疏水层析（HydrophobicInteractionChromatography,HIC）从分离纯化的机制看，属吸附层析类。利用疏水层析介质和蛋白质分子都具有一定的疏水性质，根据被分离成分与固定相之间疏水力大小的不同而进行分离。大多数蛋白质具有较强的亲水性，但分子内部存在一个疏水核心，欲让蛋白质与疏水性固定相结合在一起，可以靠蛋白质表面的一些疏水补丁（hydrophobicpatch），或让蛋白质发生局部变性（可逆），暴露出掩藏于分子内的疏水性残基。原理:在高盐浓度下，蛋白质发生局部可逆变性，被迫与疏水层析的固定相结合在一起，然后通过降低流动相的离子强度，即可将结合于固定相的蛋白质，按其结合力大小，依次进行解吸附。2.吸附剂

亲水性（如Sepharose）基质固定相疏水性（如硅胶、树脂）配体（疏水性基团）（苯基、辛基、烷基）产品名称载体配基生产公司苯基Sepharose4B琼脂糖凝胶珠苯基Pharnacia辛基Sepharose4B琼脂糖凝胶珠辛基Pharnacia烷基交联琼脂糖凝胶珠琼脂糖凝胶珠烷基(Cn)以色列一些商品疏水层析介质

3.操作1）加样：样品溶液中补加适量的盐。2）洗脱：用降低盐浓度的平衡缓冲液洗脱。3）再生：用水除去固定相吸附的杂质。4.应用主要用于分离纯化大分子物质。

（五）亲和层析(AffinityChromatography)

由吸附层析发展起来的，是从复杂混和物中纯化蛋白质的最好方法。又称：生物专一吸附（biospecificadsorption）选择层析（selectivechromatography）

1.原理

利用生物大分子间特异的亲和力来纯化生物大分子，如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；RNA和其互补的DNA等。

将待纯化物质的特异配体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，从层析柱流出，变换洗脱条件，即可将欲分离的物质洗脱下来，实现分离提纯。+CCC配基蛋白质1.配基固相化2.亲和吸附固体载体3.解吸附2.可被应用的基质（载体）：（按性能优劣排序）琼脂糖凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素。最常用的是琼脂糖，Sepharose1B到10B3.配体的选择一对可逆结合的生物分子中与载体相偶联的一方称配体。如抑制剂，底物，抗体，辅酶等。

优良配体须具备的条件：1）与待纯化的物质有较强的亲和力。2）具有与载体共价结合的基团。所要分离的目的产物

相应的配基

酶抗体凝集素激素底物、抑制剂、辅酶（辅因子）抗原、病毒、细胞多糖、糖蛋白、细胞受体受体、载体蛋白

目的产物与相应的配基

4.偶联（亲和吸附剂的制备）配体一定，改造载体（基质）1）基质活化：不同的载体活化需要不同的活化剂。常用：溴化氰（CNBr）、环氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸盐、苯醌等。溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。如用CNBr作用于葡聚糖和琼脂糖的糖羟基2）引入连接臂（spacearm）

又称手臂（spacer）“接臂”的目的：克服影响配基与生物大分子的结合的空间障碍。“接臂”的途径：常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。目前带有各种手臂的系列载体已有商品供应。如：AH-Sepharose4B常用手臂5.操作：1）层析前：制备亲和层析剂

选择根据欲分离物质特性配基

选择根据配基分子大小及基团特性载体2）洗脱：能削弱酶和亲和吸附剂间的相互作用。包括：非专一性洗脱和专一性洗脱偶联亲和层析剂非专一性洗脱：改变温度改变pH值改变离子强度专一性洗脱：竞争性洗脱剂（半抗原、抑制剂、底物类似物）被吸附物质结合竞争性地与配体结合6.应用1）纯化大分子物质如：纯化糖蛋白用凝集素（能可逆性地结合碳水化合物的蛋白质），Lectin-Sepharose4B2)研究酶的结构与功能：分离有生物活性与失去生物活性的蛋白质。

该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时,由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到被洗出。（六）层析聚焦（Chromatofocusing）层析时的聚焦效应示意图层析聚焦的操作过程：1.选择适宜的多缓冲液离子交换剂和多缓冲液溶液2.pH梯度溶液的形成

例：PBE94阴离子交换剂：起始buffer平衡到pH=9，再用pH=6buffer流过层析柱3.蛋白质的层析聚焦

层析介质pH〈pIPr+下移

层析介质pH〉pIPr-与柱结合4.洗脱过程：pH=6buffer洗脱，pH下降，Pr+下移；pH〉pI，Pr-与柱结合，不断重复洗脱-吸附-再洗脱，Pr按pI大小而被分离5.再生：同步骤2第七节电泳分离电泳（electrophoresis,EP）：

指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。电泳技术是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的实验技术。一、电泳的基本理论

1.原理:在一定pH条件下（用buffer），不同大小、形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。

+-

影响迁移率的因素：1）颗粒性质：Q越大、r越小、形状越接近球形，v越快。2）电场强度：E越高，v越快。3）溶液性质：

pH值：离pI越远，v越快。（用buffer保持恒定）离子强度：离子强度越高，v越低。原因：离子氛（ionicatmosphere）。

通常，缓冲液离子强度在0.02-0.2之间。4）电渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。应避免用高电渗物质作支持介质。自由界面电泳：又称移动界面电泳（movingboundaryelectrophoresis,MBEP），指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。区带电泳:（zoneelectrophoresis,ZEP）指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。

2.电泳的分类按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：①纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。

③琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。④聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率较高。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。

3.电泳常用设备

（1）电泳仪：为电泳提供稳定直流电源的装置。

常压电泳仪（600V）

高压电泳仪（3000V）

超高压电泳仪（30000V～50000V）（2）电泳槽：

自由界面电泳槽管状电泳槽板状电泳槽（3）附属设备：

水平板式电泳槽垂直板式电泳槽二、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。

1.凝胶制备

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，简称Bis）在催化剂和加速剂作用下聚合的。并且可以通过改变丙烯酰胺浓度和交联剂浓度而制成不同孔径的凝胶。CH2=CHC=ONH2CH2=CHC=ONHCH2NHC=OCH2=CH-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONHNH2丙烯酰胺N,N’-甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺

聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：1）化学催化系统：AP-TEMED催化剂：过硫酸铵（ammoniumpersulfate，AP）加速剂：TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）2）光催化系统：核黄素－光－（TEMED）催化剂:核黄素（维生素B2）

引发剂:光TEMED的存在，可加速聚合。.聚丙烯酰胺凝胶：丙烯酰胺＋N,N’－甲叉双丙烯酰胺聚合而成凝胶的机械强度、弹性和透明度粘着度取决于凝胶总浓度（T）和交联度（C）。

T=

C=凝胶浓度越大（小），孔径越小（大），可分离分子量较小（大）的颗粒。

Acr与Bis的重量比应在30左右。

凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系Acr（g）+Bis（g）V（ml）X100%Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%样品分子量（Da）适宜的凝胶浓度（％）蛋白质<1041～4×1044×104～1×105105～5×105>5×10520～3015～2010～155～102～5聚丙烯酰胺凝胶浓度参考表2.操作：（SDS及PAGE，即变性及非变性）1）准备：贮存液制备；玻璃板（管）洗净干燥2）制胶:（变性：buffer中加0.4%SDS）a.分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定浓度的分离胶（查表），配制分离胶溶液：Acr:Bis=29:1，分离胶buffer,TEMED,AP,水迅速倒胶，加水使液面平坦，室温0.5h聚合完全。b.浓缩胶：用浓缩胶buffer。插上梳子。3）样品制备：

a.PAGE:样品＋样品缓冲液（蔗糖或甘油＋指示剂溴酚蓝）b.SDS:样品＋样品缓冲液（SDS，甘油，巯基乙醇，溴酚蓝），煮沸2~5min，以除去亚稳态聚合。4）加样及电泳：

拔掉梳子，胶上留下凹槽，加样，倒入电极缓冲液到电泳槽中，接通电源，电泳。溴酚蓝距下端1cm时停止电泳。SDS:电极buffer中加0.1%SDS5）染色及脱色a.染色：

考马斯亮蓝染色法

银染法（灵敏度比前者高100倍）其它的染色方法：氨基黑、阿尔辛蓝等。b.脱色：用脱色液脱色至胶的蓝色完全褪去，在无颜色的凝胶上看见清晰的蓝色条带。3.分离效应

PAGE根据其有无浓缩效应，分为：不连续电泳（discontinuouselectrophoresis）

采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系连续电泳（continuouselectrophoresis）采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统电荷效应不连续PAGE分子筛效应浓缩效应

连续PAGE1）电荷效应:分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。2）分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。3）浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的不连续性表现在以下几个方面：

1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。因此，在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。8.38.38.96.7聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图

(A为正面,B为剖面)

(1)样品缓冲液pH6.7(2)浓缩胶pH6.7

(3)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3

4.应用：（少量）蛋白质的分离纯化纯度鉴定三、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）简称SDS－PAGE。是目前测定蛋白质亚基相对分子量（relativemolecularmass,Mr）的一种最好的办法。

SDSseparatesproteins1.原理：

SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫键打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质－SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。因此，蛋白质—SDS复合物(SDS-denaturedprotein)在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。2.操作（见前文）3.应用：蛋白质亚基相对分子量的测定蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下式：logM=K-bXM：分子量；X：迁移率；k、b均为常数

将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率即可在标准曲线上求得分子量。四、等电聚焦(isoelectricfocusing，IEF)利用蛋白质具有不同等电点的特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有各种连续

pI

的小分子混合物）的电泳方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF）。1.原理

两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时不再泳动，被浓缩成狭窄的区带。等电聚焦电泳2.操作：

1）凝胶配制：两性电解质载体在凝胶聚合之前加到混合液中，然后凝胶。凝胶浓度T为5％~7.5％（C=3%左右）2）加样：任意位置

3）电泳：阳极：磷酸溶液电极溶液阴极：NaOH溶液只有在凝胶两端给予高电压（600V）时，才能获得较好的分辨率。凝胶聚焦电泳一般需12h。4）固定及染色：TCA固定（凝胶浸泡在5％的三氯乙酸中去除两性电解质），考马斯亮蓝染色。5）等电点测定：Marker与未知样品同时电泳染色后，以pH值为纵轴，距阴极距离为横轴，做pH梯度标准曲线，据未知蛋白迁移距离可推知pI。IEF测定蛋白质pI3.应用：蛋白质的分离纯化测等电点第八节萃取（extraction）分离利用溶质在互不相溶的两相之间溶解度的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。特点：1）比沉淀法分离程度高2）比离子交换法选择性好、传质快3）比蒸馏法能耗低

普通有机溶剂萃取难以进行蛋白质的分离，

因为:1）蛋白质亲水性，不溶于有机溶剂2）蛋白质在有机相中易变性失活故溶剂萃取法一般仅用于抗生素等小分子生物物质的提取。

（一）有机溶剂萃取

萃取操作的3个步骤：1）混合2）分离3）溶剂回收（二）双水相萃取技术

又称水溶液两相分配技术（partionoftwoaqueousphasesystem）

用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）进行萃取。由于形成的两相均有很高的含水量（达70%〜90%），故称“双水相”系统。优点：1）每一水相中均有很高的含水量，为酶等生物物质提供了一个良好的环境；2）PEG、Dextran和无机盐对酶等无毒害作用，不会引起变性。

双水相的形成：

两种不同水溶性聚合物浓度达到一定值时，体系会自然地分成互不相容的两相，构成双水相体系。

a双节线系线b双节线均相区均相区两相区两相区系线临界点PEG/Dx和PEG/KPi系统的典型相图

几种典型的双水相系统聚丙二醇聚乙二醇、聚乙烯醇葡聚糖（Dex）羟丙基葡聚糖聚乙二醇（PEG）葡聚糖（Dex）硫酸葡聚糖钠盐聚丙烯乙二醇羧基甲基葡聚糖钠盐甲基纤维素聚乙二醇（PEG）

磷酸钾、硫酸铵硫酸钠、硫酸镁2.萃取原理：

利用生物物质在双水相体系中的选择性分配。3.应用

胞内酶的提取和精制:除去细胞碎片，并使酶得到纯化。

通常将目的蛋白分配在上相（PEG）,细胞碎片分配在下相（盐）几种典型的双水相萃取酶蛋白实例

酶菌种相系统延胡索酸酶Brevibacteriumsp.PEG/盐天冬氨酸酶E.coliPEG/盐-半乳糖苷酶E.coliPEG/盐亮氨酸脱氢酶Bacillussp.PEG/Dex乙醇脱氢酶Baker’syeastPEG/盐青霉素酰化酶E.coliPEG/盐双水相萃取法的重要研究方向——亲和萃取（亲和分配）在高分子聚合物（如PEG）上引入—具有生物特异性的配基（ligand）来提高分离选择性。

亲和萃取酶实例

蛋白质配基胰蛋白酶胰蛋白酶抑制剂磷酸果糖激酶三嗪染料甲酸脱氢酶三嗪染料葡糖-6-磷酸脱氢酶三嗪染料一种从牛肺中直接提取纯化抑肽酶的方法，它是将胰蛋白酶固定到聚乙二醇分子上，并获得适当分子量的胰蛋白酶-PEG聚合物，从而建立亲和双水相萃取体系，牛肺经过除杂、切块、捣碎后用硫酸酸解，然后过滤，滤液经过亲和双水相萃取后，最终的上相经过超滤脱盐和冷冻干燥后获得高纯度的抑肽酶产品。

（三）超临界流体萃取

兼有蒸馏和溶液萃取的特征，与常规溶剂萃取的区别：将超临界流体作为萃取剂。超临界流体(supercriticalfluid，SCF）：超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点——临界点后的流体。SCF性质介于液体和气体之间：1)SCF密度接近于液体，溶解度高。2)SCF粘度和扩散系数接近于气体，传质扩散快。基本过程：1）在SCF中，溶解度大的物质溶于其中，与不溶解或溶解度小的物质分开。2）降低压力或升温，使SCF变为气态（密度降低），溶解物质能力下降，萃取物与溶剂分离。常用超临界液态CO2作为萃取剂，

因为：1）液体CO2无毒2）临界温度（304.06K）接近常温3）临界压力（7.38MPa）较低4）操作安全超临界CO2萃取技术在生物、食品等工业中的应用

CO2萃取部分产品原料名称产物名称原料名称产物名称小麦胚芽胚芽油豆子豆油精炼油啤酒花啤酒花精油茉莉花净油辣椒辣椒红色素菊花根除虫菊酯当归精油紫草紫草宁银杏叶银杏内酯花生精炼油超临界CO2萃取有萃取和分离两步骤分离工艺分三种：①等压分离（萃取罐加热器分离罐②等温分离（萃取罐膨胀阀分离罐）③吸附分离（分离罐中置吸附剂）（四）反胶团萃取1.反胶团：又称反胶束（ReversedMicelles）指表面活性剂（由亲水的极性基团和疏水的非极性基团两部分组成）分散在连续有机溶剂中自发形成的一种稳定的纳米级的聚集体。反胶团模型亲水基团向内聚集（正）胶束反胶束形成表面活性剂溶于水，使其浓度超过临界胶束浓度。表面活性剂溶于非极性溶剂，使其浓度超过临界胶束浓度。构造表面活性剂极性基团在外，非极性基团在内，形成非极性核心。表面活性剂非极性基团在外，极性基团在内，形成极性核心，溶于水后，形成水池（waterpool）。功能溶解非极性物质溶解极性物质2.萃取过程第一步：将酶从水相中萃取到反胶束相中。第二步：将酶蛋白从反胶束转移到第二种水相中，实现对蛋白质的反萃取过程。

反胶团萃取原理

3.表面活性剂及有机溶剂

反胶团萃取与溶剂萃取的不同，是在有机溶剂中加入了少量表面活性剂。（1）表面活性剂

常用：AOT(AerosolOT)（阴离子表面活性剂，琥珀酸2-乙基己基酯磺酸钠）。特点：易获得，强度好；极性基团小，形成的反胶团空间较大，有利于蛋白质等生物大分子进入。

（2）非极性有机溶剂环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷、己醇、硅油。

4.优点1）萃取率和反萃取率高。2）分离浓缩同时进行。3）解决胞内酶在非细胞环境中迅速失活问题。4）破壁功能，直接从完整细胞提取酶蛋白。5）成本低，溶剂可反复利用。第九节

酶的浓缩、干燥与结晶一、酶的浓缩

(一)蒸发浓缩

图4-60减压蒸发浓缩的简易装置1蒸馏瓶2毛细管3螺旋夹4橡皮管5温度计6出水口7冷凝器8进水口9连接管10抽气口11接收瓶（二）

超滤浓缩

超滤(ultrafiltration)浓缩以压力差为动力，将待浓缩溶液通过超滤膜，酶分子较大被滞留，水分子和小分子选择性透过，达到浓缩目的。图4-61

酶的超滤浓缩

（三）吸水剂

1.胶过滤浓缩：

利用葡聚糖凝胶SephadexG-25或G-50等的吸水特性。将干胶直接加入样品溶液，吸水膨润后，再过滤或离心分出浓缩的酶液。2.聚乙二醇浓缩：聚乙二醇（polyethyleneglycol），简称PEG。

利用PEG的吸水特性。将PEG涂于装有酶溶液的透析袋上，置于4℃下，干PEG粉末吸收水和盐类，酶溶液即被浓缩。一般用分子量大的PEG,如PEG6,000和PEG20,000，以防止PEG进入蛋白质溶液。（四）反复冻融浓缩利用酶溶液相对于纯水冰点较低的原理使酶分子与小分子物质分离。

（五）沉淀法盐析法，有机溶剂法二、酶的干燥

酶的干燥多采用冷冻干燥法。

将酶溶液在较低温度下（-10℃~-50℃）冻结成固态，然后在高度真空条件下，将其中固态水分直接升华为气态而除去，也称酶的升华干燥。

三、酶的结晶

结晶（Crystallization）是指物质以晶体的状态从蒸汽或溶液中析出的过程。

晶体沉淀——分子排列有规则蛋白质沉淀

非晶体沉淀——分子排列无规则（无定形沉淀）

晶体内部有规律的结构决定了晶体的形成必须是相同的原子、离子或分子。

过饱和溶液的形成是结晶的原推动力和首要条件。

（一）结晶的条件

酶的纯度

纯度越高越易结晶（>50％

）

2.酶