罗氏诊断二代测序技术在HBV耐药检测中的应用

罗氏诊断二代测序技术在HBV耐药检测中的应用

罗氏诊断应用科学市场部刘璐璐HBV耐药性产生病毒每天高速复制，并在复制时发生错误，这些自发突变导致突变株出现。突变株增殖能力通常低于野生型，因而在未用药的群体中占少数。但在病毒药物作用下，药物对于耐药性的突变有选择作用，导致了耐药菌株成为优势株，导致药物治疗的失败。耐药是核苷酸类药物的共性耐药检测的意义治疗前检测，有助于临床判断用药是否有效；治疗中每3~6个月检测，有助于观察疗效，及时调整用药EASLClinicalPracticeGuidelines：ManagementofchronichepatitisB.EuropeanAssociationfortheStudyoftheLiver.JHepatol,2009,50:227-242.用药后出现耐药拉米夫定阿德福韦酯恩替卡韦替比夫定替诺福韦测序用于病毒耐药检测

深度测序可检出低频准种超深焦磷酸测序可检测低于1%的准种普通焦磷酸测序仅限5%及以上的准种毛细管电泳测序仅限20%及以上的准种提早判断准种组成，在劣势菌种未发展成为优势菌种之前，即调整用药策略；降低治疗失败可能性，减少对身体伤害。454高深度测序优势已经成功实现对于RT基因区段1%突变位点的发现，比目前常用的一代测序及线性探针反向杂交法更加灵敏进行相对定量，对于病毒群体中突变数量改变进行跟踪深度测序的运用将较传统方法提前3-6个月检测出突变，因此能够更好的抓住治疗的时机并给出治疗的方案—454测序系统发展

测序通量及读长不断增加，大小测序平台齐备—GS20GSFLXStandard20Mb~100Mb200520072008—FutureEvenLongerReadsHigherDensityLaterGSFLXTitanium~500MbGSJuniorTitaniumGSFLX+2011独立实验室适用型

精巧型二代测序平台

GSJuniorGSJunior测序步骤概览MixssDNA&capturebeads454测序流程

文库构建1.454文库构建：ShotgunPaired-end300bp~1Kb,3Kb,8Kb,20Kb*PCR产物可直接测序传统文库构建：BAC克隆->Shotgun/PCR一个片段=一个反应珠454测序流程

emPCR2.emPCR每个DNA分子独立进行PCR反应后独立测序扩增效果好，适应高GC含量片段、甚至FFPE样本一个反应珠=一个读长单克隆测序的价值

通过emPCR实现单克隆直接阅读每一种分子结果突变比例的计算（低频）基于实际的序列信息每个DNA分子独立进行PCR反应后独立测序扩增效果好，适应高GC含量片段、甚至FFPE样本Sanger流程-混合测序454流程-单克隆测序454测序流程

测序

特异的测序引物和单链DNA模板结合,加入一种dNTP

DNA聚合酶的作用下，单个dNTP与模板的下一个碱基配对，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)

在ATP硫酸化酶的作用下，PPi和APS结合形成ATP在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光，被CCD捕捉Apyrase降解剩余的dNTP和残留的少量ATP加入另一种dNTP重复2-5步骤在每一个测序循环里，碱基以同样的次序(TACG)流过PicoTiterPlate板当模板链的互补核苷酸加入延伸链时，会产生了荧光信号荧光信号强度与所加入的核苷酸数目成比例荧光信号被CCD照相机记录荧光素酶ATP硫酸化酶氧化荧光素可见光3.基于焦磷酸反应的边合成边测序13SequencingBySynthesisAATCGGCATGCTAAAAGTCACTARepeateddNTPflowsequence:GGTCAGTCAGTTTTCAGGATCCCGATTGCTAAnnealPrimerProcesscontinuesuntiluser-definednumberofnucleotideflowcyclesarecompleted.边合成边测序实验体系的不断优化使得当前可获得Junior平均为400bp的读长并将继续以提升读长为技术的发展方向之一454测序流程

数据获取

图像处理信号处理454测序流程

数据分析

测序与分析同时进行，10小时完成10小时产出10万条以上的序列自带4套软件，满足多数应用需求软件自动过滤，高质量序列比例高400bp的位置仍可保持Q20的准确性GSJunior在德国大肠杆菌事件中

NicholasJLomanetal.,Performancecomparisonofbenchtophigh-throughputsequencingplatforms,NatureBiotechnology,2012[DOI:10.1038/nbt.2198]454GSJunior拥有最长的读长，平均读长在522个碱基，99%的序列可以用于基因组拼接6月3日收到样本，6月5日完成全部测序与机制确认工作数据分析仅由HPA的非专业生信团队，不到半天时间即得到结果序列读长分布图

Junior测序系统运行产生的读长范围为50-600bp，甚至更长shotgun实验将利用几乎全部数据平均读长为400bp典型读长在450-550bp范围Amplion实验将主要根据典型读长进行PCR引物设计NumberofreadsReadlength(bases)SimplesimpleCGTAGGCTAGATGCATGCAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGATATAGCGATCTCGACATGCTComplex454longreadsShortreadtechnology?????454长测序能够带来什么

emPCR保证样本的获得，长焦磷酸确保阅读

长读长的价值

一条reads通读一个目标序列，无需拼接，避免错误产生与时间消耗通过一条reads判断突变的连锁关系更少引物获得更多目标引物设计的区间更灵活Junior1条reads既可通读HBV耐药相关基因的PCR产物HBV耐药RT基因(1032nt)检测有overlap的4个片段Fragment1(372nt)9Fragment2(401nt)9Fragment3(396nt)9Fragment4(314nt)9TheJournalofInfectiousDisease,May2009;199(9):1275-85.PCR扩增子文库的设计

长读长给予更多引物设计空间，1条reads通读热点突变区域454B-primer(19bp)LocusspecificPCRamplificationemPCR&双向测序Targetspecificsequence(ca.25bp)454A-primer(19bp)ABSequenceofinterest200–400bp通过MID序列，可以混合多个样本测序同时测序DataanalysisRT基因可设计3个PCR产物片段S基因可设计2个PCR产物片段C基因可设计1个PCR产物片段X基因可设计1个PCR产物片段Pre-C基因可设计1个PCR产物片段454测序在HBV耐药基因测序的应用方案Day1DNA提取Day1PCR产物的获取Day1PCR产物纯化Day1PCR产物样品定量(Agilent2100,qPCR仪)Day1PCR产物样品均一化Day1PCR产物混样Day1454测序建库加接头(10min)Day2emPCR扩增(2h手工操作+6h机器运行)Day3454Junior测序(10h)Day4数据分析454测序步骤

HBV耐药检测应用emPCR(乳滴PCR)扩增每一带有MID与测序引物的HBV耐药突变高发DNA片段在其各自的微乳滴中进行独立扩增，排除了其它竞争性或污染性序列对PCR反应的影响。焦磷酸测序将所有结合有DNA片段的磁珠置于PicoTiterPlate(PTP板)中进行测序。PTP板的孔径恰好仅能容纳一颗磁珠。将PTP板置于GS测序仪中，单个核苷酸依次流经孔洞和DNA捕获磁珠间。当所加入的核苷酸与模板互补时，便产生化学发光信号，进而被GS系统的CCD相机记录。454的分析结果呈现

可检测单点突变454的分析结果呈现

可关注已知突变MultipleMutationsinaCodonAssociatedwithNRTIResistanceT69ConfidentialMultipleMutationsinaCodonAssociatedwithNRTIResistanceThr6935%Alanine,42%Asparagine,and1.2%SerineConfidential454的分析结果呈现

可检测有意义的连锁突变位点已有RT基因突变数据库

StandfordHBVSeq

StandfordHBVSeq结果展示近两年使用454发表HBV耐药检测文献AnalysisofhepatitisBvirusdrug-resistantmutanthaplotypesbyultra-deeppyrosequencing.KoSY,OhHB,ParkCW,LeeHC,LeeJE.(2012)ClinMicrobiolInfectePub:Ultra-deeppyrosequencingdetectsconservedgenomicsitesandquantifieslinkageofdrug-resistantaminoAcidchangesinthehepatitisBvirusgenome.Rodriguez-FríasF,TaberneroD,QuerJ,EstebanJI,OrtegaI,DomingoE,CuberoM,CamósS,Ferrer-CostaC,SánchezA,JardíR,SchaperM,HomsM,Garcia-CehicD,GuardiaJ,EstebanR,ButiM.(2012)PLoSOne7(5):e37874.Long-termmonitoringdrugresistancebyultra-deeppyrosequencinginachronichepatitisBvirus(HBV)-infectedpatientexposedtoseveralunsuccessfultherapyschemes.SedeM,OjedaD,CassinoL,WestergaardG,VazquezM,BenettiS,FayF,TannoH,QuarleriJ.(2012)AntiviralResearchePub:Ultra-deeppyrosequencinganalysisofthehepatitisBviruspreCoreregionandmaincatalyticmotifoftheviralpolymeraseinthesameviralgenome.HomsM,ButiM,QuerJ,JardíR,SchaperM,TaberneroD,O