仪器流式细胞仪(术)2010

流式细胞仪（术）FlowCytometry(FCM)双激光(488nm,635nm)四荧光参数分选加细胞富集系统FACSCaliburFACSVantageSE多激光多波长八荧光参数

高速分选单细胞点对点分选什么是流式细胞术？流式细胞术流式细胞术（FCM）是利用细胞生物学，电子学，流体力学，免疫学，激光技术，电脑技术对各种血细胞及组织细胞，微生物的理化特性进行定量分析，并能对特定细胞群体加以分选的细胞参量分析技术。“流式”是指测量过程中细胞是流动的，不是静止的。这是与在此之前的细胞测量技术的最大差异之处。FCM应用范围细胞大小细胞的复杂程度细胞表面抗原（标志物）的检测细胞浆内标志物（细胞因子、细胞器）的检测细胞核内因子的检测（如P53）DNA含量/细胞周期的测定细胞功能测定（活化、凋亡、死亡）FCM的结构组成细胞流动室及液流驱动系统激发光源及光束形成系统细胞信号检测与分析、显示、记录系统各系统按三个互为垂直的轴线安置X轴方向——激发光轴线Y轴方向——细胞荧光信号检测轴线Z轴方向——细胞流轴线原理图和流动室图FCM工作原理

待细胞被制备成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在气体的压力下进入流动室。流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排成单列由喷嘴流出，成为细胞液柱。液柱与入射的激光束垂直相交，相交点为检测区。每一个细胞通过检测区时受到激光照射，产生散射光信号和荧光信号，这些信号由yi的检测系统收集、分析、处理。FCM液流系统示意图不同样本速率形成的样本流

低速高速长通滤片短通滤片带通滤片工作流程示意图细胞信号的检测与分析细胞散射光信号前向角散射信号——FSC（ForwardScatter)侧向角散射信号——SSC(SideScatter)细胞散射光信号新鲜未经处理的细胞受到光照时产生的散射现象前向角散射信号——FSC（ForwardScatter)意义：反映细胞大小与活力，细胞越大，活力越强，信号越强用途：设阈值排除碎片对被测细胞的干扰。设门分析所需细胞亚群。区分死活细胞。前向角散射信号FALSSensorLaser侧向角散射信号——SSC(SideScatter)意义：反映细胞内部结构形态等信息，特别是胞质内的颗粒成分。内部结构越复杂，信号越强。用途：外周血样品中区分颗粒细胞与其他白细胞。同一细胞群中部分细胞生理或病理变化，如细胞凋亡时SSC增大。侧向角散射信号FALSSensor90LSSensorLaser外周血细胞亚群细胞荧光信号经过特异荧光染色后，细胞受激光照射而发射的荧光信号FL1，FL2，FL3，FL4四个荧光通道分别接收四种不同波长的荧光信号。如何选择合适的荧光素所选荧光素必须被机器所配激光管激发荧光素的发射光谱必须与滤波片相适合多种荧光素光谱之间的重叠应该最小PropidiumIodide碘化丙啶400nm500nm600nm700nmPIDNAExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmFluorescein(FITC)

异硫氰酸荧光素400nm500nm600nm700nmWavelengthProteinExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmPhycoerytherin(PE)

藻红蛋白ExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmProteinAllophycocyanin(APC)

别藻蓝蛋白Protein632.5nm(HeNe)ExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmFITC和PE荧光光谱补偿模型图补偿前后比较荧光信号的测量方式荧光信号的线性测量：放大器的输出与输入是线性关系，用于荧光信号变化范围较小的参量。如DNA、RNA、总蛋白含量的测量。荧光信号的对数测量：放大器的输出与输入是对数关系，用于荧光信号变化范围大，参量相差几十，几百倍，如细胞膜表面抗原DNA直方图，二维点图FCM的数据显示和分析单参数直方图显示FCM的数据显示和分析双参数数据显示：提供细胞与二个参数之间的关系，同时提供二个参数之间的相关关系FCM的数据显示和分析多参数数据显示：目前FCM对细胞测量已是多参数的，要在单一图上显示这众多参数是不可能的。同时对参数的“设门”分析可以调出其他参数的有关关系。多参数数据显示FCM的数据分析单参数分布直方图的设区分析——阳性细胞表达细胞DNA含量分布的数据分析——计算机拟合法双参数数据的设门分区分析多参数的数据分析流式细胞术的质量控制FCM仪器的校准与标准化：标准荧光微球（Beads）和鸡红细胞（CRBC）是最常用的参考标准。FCM的测量分辨率一般用变异系数CV值表示，CV值越小，分辨率越高FCM仪器光学调整到最佳状态时，标准微球CV值＜＝2%，鸡红细胞，人外周血淋巴细胞CV值越为3%流式细胞术的质量控制FCM检测DNA倍体的标准

分离正常人外周血淋巴细胞是最常用的DNA分析和DNA异倍体（DNAAneuploid，DA）检测的对照物免疫荧光研究中的对照细胞自发荧光用同型免疫球蛋白（isotype）测得非特异荧光值用已知阴性细胞或阳性细胞双荧光或多荧光FCM分析中的荧光补偿（Flouorescencecompersation）FCM的样品制备技术一、单层培养细胞分散为单个细胞1）将培养瓶中培养液弃去2）加入少量0.25%胰酶过一遍3）加入1-2ml0.25%胰酶，在倒置显微镜下见细胞变圆，立即竖起培养瓶弃去胰酶4）加入3-4ml无Ca2+、Mg2+的PBS，用吸管反复吹打，使之成单细胞悬液，移入离心管。5）离心，弃上清，约留0.5ml细胞悬液，用震荡器使细胞分散。6）用细滴管或注射器迅速将细胞注入4ºC，70%冷乙醇，保存于-20ºC冰箱中。FCM的样品制备技术二、实体组织分散为单个细胞对于不同来源的组织，虽然每用通用方法，常用的分散细胞的方法如下：1）酶消化法：原理酶是蛋白质大分子，不能进入活细胞膜，但可破坏细胞间的胶原纤维，水解细胞间的粘多糖成分，分解细胞之间的紧密连接，使细胞从组织上游离到悬液中，制成细胞悬液。FCM的样品制备技术常用酶类试剂： 胃蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶，木瓜蛋白酶，胶质酶，透明质酸酶酶消化的最佳温度与持续时间 温度：37ºC

时间：15-20分钟 用量：每克组织10-15mlFCM的样品制备技术2）机械法：用物理方法给组织较大压力，使细胞从组织中分散开剪碎法：用锋利尖刀将组织剪碎成糊状。网搓法：将小块组织置于金属网、尼龙网上搓磨研磨法：用细胞研磨器将小块组织研磨成匀浆*机械法制成的细胞悬液须用尼龙网过滤除去大团块，低速离心，弃上清，去除细胞碎片。FCM的样品制备技术3）化学试剂处理法：常用试剂：EDTA、EGTA、TPB、TrionX-100FCM的样品制备技术三、细胞荧光染色方法1）免疫荧光染色利用FCM与单克隆抗体技术相结合，极大的推动免疫学的发展，使传统免疫学提高到定量研究水平。采用试剂：各种荧光探针标记单克隆抗体检测范围：细胞膜抗原、细胞内功能性抗原，癌基因表达蛋白等染色方式：直标、间标Directstaining直接染色FluorescentprobeattachedtoantibodySpecificsignal:weakNonspecificbinding:lowIndirectstaining间接染色Fluorescentprobeattachedtoa2ndantibodySpecificsignal:strong,5-62ndAb/each1stAb;Nonspecificbinding:highFCM的样品制备技术荧光抗体的选择：对同时检测细胞几种不同抗原的表达量时需选择几种不同的荧光素标记的抗体。当被激光照射后，由于不同的荧光素具有不同的发射波长，因此被相应的荧光通道接收，每一通道接收的荧光信号代表相应标记抗体特异结合的抗原双标记染色FCM的样品制备技术2）特异性荧光探针染色一些荧光探针对细胞内的物质成分，特殊结构，具有特异性结合能力，如：DNA探针（DNAprobes）:PI、EB、AO、Ho33258/33342、FAHO、DAPI、CA3等RNA探针（RANprobes）:AO，PY蛋白质探针（proteinprobes）:FITC线粒体探针（mitodiondrialprobes_):Rh123,DiDc6Ca2+探针:Quin-1,Fara-2,Indo-I,Fluo-3FCM在医学生物学中的应用细胞生物学免疫学肿瘤学血液学药理学生殖医学微生物学寄生虫学FCM在细胞生物学中的应用

CellProliferationCellCycle

细胞增殖细胞周期*细胞DNA含量*增殖相关抗原的表达*BrdUrd的插入*示踪染料FCM在细胞生物学中的应用1）细胞周期分析

用PI染色可测出细胞各时相（G0/G1，S，G2/M）所占百分比正常细胞周期G2MG0G1s02004006008001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontentCount2N4N典型DNA直方图G0-G1SG2-MFluorescenceIntensity#ofEvents2）细胞增殖的检测

DNA含量检测

PCNA：增殖细胞核抗原，表达S期比率

Ki-67：细胞增殖相关抗原，表达于G1，S，G2M各阶段细胞上

Ki-S1：细胞增殖相关抗原

CD71（转铁蛋白受体）：表达在大多数增殖细胞上

cyclinD1，E，A，B1

FCM在细胞生物学中的应用BrdUrdIncorporation溴脱氧尿核苷，是胸腺嘧啶类似物。可以测定细胞增殖和细胞周期状态。BrdU插入到细胞周期的DNA中。插入的BrdU可以被抗BrdU抗体检测到。BrdUrdIncorporationFCM在细胞生物学中的应用3）细胞凋亡I）DNA亚二倍体峰，检测晚期凋亡II）AnnexinV检测早期凋亡III）线粒体功能检测Apo2-7，位于线粒体膜上，早期凋亡时出现IV）缺口末端标记法：Tunel或TDT法V）Caspase-3检测FlowcytometryofapoptoticcelldeathCelllightscatterDuringtheinitialstagesofapoptosisthecellshrinks,asaconsequencetheFSCdecreases,whileSSCincreasesorremainsunchanged.DNA亚二倍体峰，检测晚期凋亡PI-Fluorescence#EventsApoptoticcellsNormalG0/G1cells荧光显微镜和电子显微镜照片缺口末端标记法：Tunel或TDT法Tunel法Tunel法FCM在免疫学中的应用人细胞表面分子检测，CD系列人三大免疫细胞水平检测T，B，NK活化淋巴细胞检测CD69，CD25，CD71，HLA-DR细胞内部各种细胞因子检测IFN-γ，IFN-α

，IL-2，IL-4等移植配型自身免疫性疾病：SLE，强直性脊柱炎AIDS：检测病程及患者免疫状态FCM在医学免疫学中的应用淋巴细胞免疫分型 荧光染料标记单克隆抗体与淋巴细胞表面的抗原结合，结合多色荧光分析。即可以把各种不同功能的淋巴亚群区分开来，进而得到各亚群的相对比例。FCM在医学免疫学中的应用CD45/CD14：区分粒细胞、单核细胞和淋巴细胞IsotypeControl（1/2a）：阴性对照，确定FL1和FL2的非特异性结合水平，界定阴性和阳性细胞群体。CD3/CD19：鉴别T淋巴细胞和B淋巴细胞CD3/CD4：鉴别T辅助/诱导淋巴细胞CD3/CD8：鉴别T抑制/毒性淋巴细胞CD3/CD16+56：鉴别T淋巴细胞和NK淋巴细胞全血样本荧光抗体染色步骤在各实验管中加入20ul抗体每管加入100ul全血，振荡混匀，室温暗处反应15分钟。加入2ulFACS溶血素，震荡混匀，室温暗处10分钟。300×g离心5分钟，弃上清。震荡混匀加入1ml洗液。300×g离心5分钟，弃上清。震荡混匀，加入300ul1%多聚甲醛。2-8ºC暗处保存，24小时内上机检测。淋巴细胞亚群与疾病疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫性疾病系统性红斑狼疮类风湿性关节炎自身免疫性溶血性贫血重症肌无力免疫缺陷病爱滋病病毒感染传染性单核细胞增多症慢性活动性肝炎活动性肝硬化肿瘤消化道癌,肝癌,肺癌再生障碍性贫血粒细胞减少症淋巴细胞亚群检测意义疾病机理研究

疾病辅助诊断移植后免疫检测治疗方案的确定及疗效评价CD25高于正常值5-10%,表明即将或已发生排斥CD4/CD8比值下降提示并发凶险感染

<0.2时,必须停用免疫抑制剂CD2+HLA-DR+增加5-10%,且不伴有CD25的增加,提示巨细胞病毒感染慢性疲劳,感染后综合征,纤维肌痛,类风湿性关节炎,过敏等

疾病预防淋巴细胞亚群检测意义

Control（n=20)ActiveSLE(n=17)StableSLE(n=13)CD370.4±5.8765.8±10.968.5±8.95CD435.0±5.7022.1±4.15**34.5±4.23CD827.9±5.7345.7±9.58**32.7±9.01CD4/CD81.27±0.140.43±0.12**1.05±0.26*NK17.8±5.484.37±3.31**7.59±5.01**鉴别活动期和非活动期SLETh1/Th2细胞PMA+Ionomycin刺激4-6hrTraditionalCytokineFlowCytometryIL-2PhycoerythrinCD4FITCAntigenSpecific

CytokineFlowCytometryCD69PEanti-TNFFITCFCM细胞因子染色步骤细胞经4-8小时培养。每管加2ml红细胞裂解液，避光10分钟，1000r/分离心5分钟，弃上清。加2mlPBS缓冲液洗1次离心，弃上清。每管加单抗20ul，室温避光15分钟。2ml缓冲液洗1次。1000r/分离心5分钟，弃上清。每管加4%多聚甲醛500ul，固定20分钟。1000r/分，离心5分钟弃上清。FCM细胞因子染色步骤每管加0.1%皂素的PBS2ml破膜10分钟，1000r/分离心5分钟，弃上清。每管加抗细胞因子单抗0.2ul，室温避光孵育30分钟。2ml含0.1%皂素PBS洗1次，1000r/分，离心5分钟，弃上清。每管加500ulPBS/2%多聚甲醛悬浮细胞，上机检测。*细胞培养需加入刺激剂：PMA：ionomycin蛋白转运抑制剂：MonensinTh1/Th2失衡相关疾病嗜曙红细胞增多和IgE升高相关疾病

Ommen’sSyndrome(Ommen’s综合征)HyperosinophilicSyndrome(高嗜曙红细胞综合征)Kimura’sDisease(Kimura’s疾病)Well’sSyndrome(Well’s综合征)传染病

病毒性疾病

人类免疫缺陷性病毒感染和爱滋病(AIDS)

麻疹

呼吸道合胞体病毒感染

慢性活动性乙型肝炎病毒感染

分枝杆菌和其它细菌感染

麻疯病

肺结核

鸟结核分枝杆菌复合感染

细胞内细菌感染

滑膜炎反应性关节炎

淋病和梅毒

Th1/Th2失衡相关疾病

寄生虫病

原寄生虫感染：皮肤和内脏利什曼病

蠕虫病：丝虫病和血吸虫病真菌性疾病

过敏性支气管肺霉菌病

念珠菌病

隐球菌病

类球孢子菌病

芽生菌病

球孢子菌病

组织胞浆菌病恶性肿瘤

皮肤基底细胞和鳞细胞癌

SezarySyndrome(Sezary综合征)

淋巴瘤

EBV相关的B细胞和非何杰金氏淋巴瘤

何杰金氏淋巴瘤

大细胞退行性(CD30+)淋巴瘤

多发性骨髓瘤和Castleman’s综合征

卡氏肉瘤Th1/Th2失衡相关疾病变应性疾病

皮肤性哮喘

变应性哮喘

春季结膜炎炎性和自身免疫性疾病

巨细胞(暂时性的)动脉炎

系统性红斑狼疮

类风湿性关节炎

自身免疫性甲状腺疾病

类肉瘤病

银屑病(牛皮癣)IgA肾病

多发性硬化Th1/Th2细胞检测意义疾病治疗发病机制研究使用Th1和Th2相关的细胞因子

IFN-治疗麻疯病

用抗Th1和Th2相关细胞因子或其受体的抗体

抗IL-4抗体治疗真菌和寄生虫感染

使用调节Th1/Th2细胞因子平衡的药物:

萨力多胺(Thaliodomide)治疗巨细胞动脉炎疾病治疗监测FCM检测外周血树突状细胞 DC（DendritiCell）主要功能是吸收抗原，进行加工，并向T淋巴细胞呈递，它与其他有此功能的细胞不同的是，DC具有诱发初发免疫反应的独特功能。DC存在于外周淋巴组织中，已在血液和非淋巴组织中发现了不同类型的DC细胞，被认为是淋巴组织中细胞的前体。目前研究DC细胞进行抗肿瘤，抗感染治疗。FCM检测外周血树突状细胞外周血中两种类型DC：CD123+、CD11c+DC活化的标志：CD83、CMPF-44DC检测DC检测FCM检测外周血树突状细胞FCM检测外周血树突状细胞FCM检测外周血树突状细胞FCM在肿瘤学中的应用FCM细胞DNA含量测定已用于 临床肿瘤诊断 检测癌前病变 交界性肿瘤诊断 肿瘤预后估计 疗效评价检测癌基因和抑癌基因的表达在肿瘤发生发展过程中的作用FCM在肿瘤学中的应用DNA指数（DNAIndex，DI）通常用来描述DNA含量的偏离程度和倍体水平。定义正常二倍体细胞，DI=1.0。被测样品DI为

被测样品G0/G1细胞DNA量平均数DI=

正常二倍体细胞DNA量平均数FCM在肿瘤学中的应用DNA指数（DI）意义0.5单倍体2.0四倍体非0.5、1.0、2.0非整倍体或异倍体＜

1.0亚二倍体＞1.0超二倍体二倍体与异倍体疗效评价肿瘤检测基因表达蛋白的检测

细胞癌基因和抗癌基因的各种蛋白的产物在调控细胞增殖、分化和肿瘤的发生中起着重要的作用。基因检测抗癌基因检测Rb、P53（V）、P16癌基因检测P21、Bcl-2、C-erbB-2调整基因检测CD44（S）、CD44（V5）、CD44（V6）、nm23其他基因表达蛋白P-170、CD95：Apo-1/FasFCM在血液学中的应用

FCM通过对外周血或骨髓细胞表面抗原和DNA的检测，对各种血液病的诊断、预后起着举足轻重的作用FCM在血液学中的应用白血病的诊断和治疗各种血细胞系统都具有其独特的抗原，当形态学检查难以区别时，免疫表型、参数对各种白血病的诊断和鉴别诊断有决定性的作用FCM在血液学中的应用各系血细胞的独特抗原 干系：CD34

髓系：CD13、CD14 B系：CD10、CD19、CD20 T系：CD2、CD3、CD5、CD7FCM在血液学中的应用移植配型

FCM测定CD34，HLA-DR，CD33成为干细胞移植技术的重要手段FCM在血液学中的应用阵发性血红蛋白尿症（PNH）

PNH是一种获得性克隆基因失调，CD59、CD55抗原表达减低是该病的一个特征。临床表现是血管内皮出血和再栓塞。PNH的诊断FCM在血液学中的应用网织红细胞的测定 网织红细胞的计数是反映骨髓造血功能的重要指标。FCM通过某些荧光染料与红细胞中的RNA结合，定量测定网织红细胞中的RNA，得到网织红细胞占成熟红细胞的百分比。FCM在血液学中的应用临床应用

干细胞移植术后恢复的判断 贫血的治疗检测 肿瘤病化疗对骨髓的抑制状况FCM在血液学中的应用血小板功能检测 血小板活化时其质膜糖蛋白较其静止时发生着显著改变。FCM可通过单抗的免疫荧光标记血小板膜糖蛋白、CD36、CD41、CD61、CD62p、CD63、PAC-1。监测血小板功能及活化状态。FCM在血液学中的应用

临床应用先天性或获得性血小板疾病。如：血小板无力症，巨血小板综合症，骨髓增生性疾病血栓栓塞性疾病：心肌梗死、脑栓塞、心绞痛、短暂性脑缺血发作等血小板减少性紫癜评价血小板活化程度抗血小板药物治疗检测FCM在血液学中的应用FCM在药理学中的应用

从FCMDNA直方图变化分析，研究化疗药物的作用机制和位点，是否周期特异性或时相特异性，直观了解化疗药物对癌细胞动力学干扰和影响。FCM在药理学中的应用用药前用药后FCM在生殖医学中的应用FCM在精子发生学，睾丸瘤，不育症，药物对精细胞的干扰等研究都可进行定量研究。特别是可以进行X、Y精子的分选FCM在生殖医学中的应用FCM在生