第四章 (一) 色谱法概述

第四章

（一）色谱法概述一、概述俄国植物学家茨维特在1906年使用的装置：色谱原型装置，如右图。混合物样品在色谱柱中的分离情况☆色谱法是一种分离技术；☆试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。☆其中的一相固定不动，称为固定相；☆另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。从不同角度，可将色谱法分类如下：色谱法分类二、色谱流出曲线及其有关术语由检测器输出的电信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线（见右图）。曲线上突起部分就是色谱峰。如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线（气固吸附色谱）或分配等温线（气液分配色谱）的线性范围内，则色谱峰是对称的，可用Gauss正态分布函数表示:C:不同时间t时某物质的浓度；C0:进样浓度；tr:对应于浓度峰值的保留时间；σ:标准偏差。1.基线：无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。2.保留值(1)时间表示的保留值:保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间。(2)死时间(tM):

不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间。(3)调整保留时间(tR’):

tR＇=tR-tM

续（2）用体积表示的保留值保留体积（VR）：VR=tR×F0F0为洗脱液流速。单位：mL/min。死体积（VM）：

VM=tM×F0调整保留体积（VR＇）：

V

R＇=VR

－VM

续(3)相对保留值r2,1某组分2

的调整保留值与组分1

的调整保留值之比．称为相对保留值。由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与栓径、柱长、填充情况及流动相流速无关。因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。3.区域宽度色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有三种方法。(1)标准偏差σ：即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。

(2)半峰宽Y1/2：即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为:Y1/2＝2.354σ.(3)峰底宽度Y：即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏差σ的关系是：Y=4σ

从色谱流出曲线中，可得许多重要信息。从色谱流出曲线中可得信息:(i)根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少个数；(ii)根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；(iii)据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；(iv)色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据；(v)色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(或流动相)选择是否合适的依据。三、色谱法基本原理

色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠、还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。下图是A、B两组分沿色谱柱移动时，不同位置处的浓度轮廓。图中KA＞KB，因此A组分在移动过程中滞后。随着两组分在色谱柱中移动距离的增加，两峰间的距离逐渐变大，同时每一组分的浓度轮廓(即区域宽度)也慢慢变宽。显然，区域扩宽对分离是不利的、但又是不可避免的。若要使A、B两组分完全分离，必须满足以下三点：续第一，两组分的分配系数（即与固定相的结合能力）必须有差异；第二，区域扩宽的速率应小于区域分离的速度；第三，在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。前两点是完成分离的必要条件。1.分配系数和分配比（1）分配系数K

分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配过程，而吸附色谱的分离是基于反复多次地吸附—脱附过程。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数K。它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动向之间分配达到平衡时的浓度之比值，即分配系数K的讨论(a)

一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；(b)试样一定时，K主要取决于固定相性质；(c)

每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；(d)

选择适宜的固定相可改善分离效果；(e)

试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流出。

分配系数是由组分和固定相和流动相的热力学性质决定的，它是每一个溶质的特征值。它仅与固定相和流动相的性质及温度有关

。与两相体积、柱管的特性以及所使用的仪器无关。分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时固定相和流动相中的质量比。即（2）分配比kk值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。续可以证明：k是组分的调整保留时间与死时间之比。即:式中Cs，Cm分别为组分在固定相和流动相的浓度；Vm为柱中流动相的体积，近似等于死体积。Vs为柱中固定相的体积，在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。例如：在分配色谱中，Vs表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。k=tr/tm2.塔板理论色谱柱长：L；虚拟的塔板间距离：H；色谱柱的理论塔板数：n；则三者的关系为：n=L/H（1）理论假定把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标。该理论假定：(i)

在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱称为理论塔板高度H。(ii)

流动相进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积(ΔVm)。(iii)所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴(纵)向扩散可忽略。(iv)

分配系数在所有塔板上是常数。与组分在某一塔板上的量无关。续n=L/Hn称为理论塔板数。色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随板高H的增大而减小。对一根长为L的色谱柱，溶质平衡的次数应为：（2）塔板分离示意为简单起见，(a)设色谱柱由5块塔板(n=5,n为为柱子的塔板数)组成，编号，分别为0，1，2，...，n-1。(b)某组分的分配比k=1.该组分的分布可计算如下：续（1）开始时，若有单位质量，即m=1(1mg或1ug)的该组分加到第0号塔板上，分配达平衡后，由于k=1，即p=q,故p=q=0.5.（2）当一个板体积(1ΔV)的淋洗液以脉动形式进入0号板时，就将流动相中含有q部分组分的淋洗液顶到顶到1号板上，此时0号板液相中p部分组分及1号板流动相中的q部分组分，将各自在两相间重新分配，故0号板上所含组分总量为0.5，其中流动相和固定相两相各为0.25；而1号板上所含总量同样为0.5，流动相和固定相两相亦各为0.25。以后每当一个新的板体积流动相以脉动式进入色谱住时，上述过程就重复一次，如上图所示。（3）塔板理论结论第一当溶质在柱中的平衡次数，即理论塔板数n大于50时，可得到基本对称的峰形曲线。在色谱柱中，n值—般是很大的，如气相色谱柱的n约为103-106。因而这时的流出曲线可趋近于正态分布曲线。第二当试样进入色谱柱后，只要各组分在两相间的分配系数有微小差异，经过反复多次的分配平衡后，仍可获得良好的分离。第三

n与半峰宽度及峰底宽的关系式为：式中tR与Y1/2(或Y)应采用同一单位(时间或距离).可以看出，在tR一定时，如果色谱峰越窄，则说明n越大，H越小．柱效能越高。续在实际工作中，常用有效塔板数n有效表示柱效：因为在相同的条件下，对不同的物质计算所得的塔板数不一样，因此，在说明柱效时，除色谱条件外，还应指出是用什么物质来进行测量的。（4）例题（理论塔板数的计算）已知某组分峰的峰底宽40s，保留时间为400s，计算此色谱柱的理论塔板数。解：3.速率理论-影响柱效的因素1956年荷兰学者范.弟姆特（VanDeemter）等在研究气液流色谱时，提出了色谱过程动力学理论—速率理论。他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对气相、液相色谱都适用，VanDeemter方程的数学简化式为：续式中H：理论塔板高度，u为流动相的线速度；A，B,C为常数，分别代表了涡流扩散项系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。（1）改变A、B、C三项可提高柱效；（2）存在着最佳流速；（3）A、B、C三项各与哪些因素有关？（1）涡流扩散项A

在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动，故称涡流扩散。

由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性，使组分在色谱柱中路径长短不一，因而同时进色谱柱的相同组分到达柱口时间并不一致，引起了色谱峰的变宽。色谱峰变宽的程度由下式决定：续A=2λdpLA与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子λ有关，与流动相的性质、线速度和组分性质无关。为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。对于空心毛细管，不存在涡流扩散。因此A＝0。(2)分子扩散项B／u(纵向扩散项)

纵向分子扩散是由浓度梯度造成的。组分从柱入口加入，其浓度分布的构型呈“塞子”状。如右图所示。它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，“塞子”必然自发地向前和向后扩散，造成谱带展宽。分子扩散项系数为：B＝2γDg

(a)柱内谱带构型；(b)相应的响应信号。式中γ是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素,也称弯曲因子，它反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况,填充柱色谱,γ<1。Dg为组分在流动相中扩散系数(cm2·s-1)。续Dg与流动相及组分性质有关（柱温；柱压等）：(a)

扩散导致色谱峰变宽，H↑(n↓)，分离变差;(b)

分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑;(c)

扩散系数：Dg∝（M载气）-1/2；M载气↑，B值↓。对于液相色谱，组分在流动相中纵向扩散可以忽略。(3)传质阻力项C·u传质：物质系统由于浓度不均匀而发生物质迁移的过程。影响这个过程进行速度的阻力，叫传质阻力。C=（Cg+CL）传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL，液相相传质阻力大于气相传质阻力。即：

续(a)

对于气液色谱。传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。传质过程中试样组分将在两相间进行质量交换，即进行浓度分配。有的分子还来不及进入两相界面，就被气相带走；有的则进入两相界面又来不及返回气相。这样，使得试样在两相界面上不能瞬间达到分配平衡，引起滞后现象，从而使色谱峰变宽。(b)

对于液液分配色谱，传质阻力系数(C)包含流动相传质阻力系数(Cm)和固定相传质阻力系数（Cs），即：

C=Cm+Cs（4）流动相线速度对板高的影响(a)LC的H—u图对于—定长度的柱子，柱效越高，理论塔板数越大，板高越小。但究竞控制怎样的线速度，才能达到最小板高呢?根据vanDeemter公式作LC的H～u图.不难看出：对应某一流速都有一个板高的极小值，这个极小值就是柱效最高点.(b)分子扩散项和传质阻力项对板高的贡献

较低线速时，分子扩散项起主要作用；较高线速时，传质阻力项起主要作用；其中流动相传质阻力项对板高的贡献儿乎是一个定值。在高线速度时，固定相传质阻力项成为影响板高的主要因素．随着速度增高板高值越来越大，柱效急剧下降。1.H—u关系曲线2.固定相传质阻力项(Cgu)3.流动相传质阻力项(Cmu)4.分子扩散项(B／u)分子扩散和传质阻力项对板高的贡献(c)固定相粒度大小对板高的影晌

固定相粒度对板高的影响是至关重要的。实验表明不同粒度，H-u曲线也不同.粒度越细，板高越小，并且受线速度影响亦小。这就是为什么在HPLC中采用细颗粒作固定相的根据。当然．固定相颗粒愈细，柱流速愈慢。只有采取高压技术，流动相流速才能符合实验要求。粒度尺寸对板高的影响

塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：

保留值之差──色谱过程的热力学因素；区域宽度──色谱过程的动力学因素。

4.分离度色谱分离中的四种情况如图所示：续①柱效较高，△K(分配系数)较大,完全分离；②△K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；③柱效较低，△K较大,分离的不好；④△K小，柱效低，分离效果更差。分离度：定义为相邻两组分色谱峰保留值之差，与两组分色谱峰底宽总和之半的比值，即续(a)两色谱蜂距离近并且峰形宽，两峰严重相叠，这表示选择性和柱效都很差。(b)虽然两峰距离拉开了，但峰形仍很宽，说明选择性好，但柱效低。(c)分离最理想，说明选择性好，柱效也高。R<1时，两峰总有部分重叠；R=1时，两峰能明显分离；R=1.5时，两峰已完全分离。R=0.8：两峰的分离程度可达89%；R=1.0：分离程度98%；R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。四、应用1.定性分析(1)利用纯物质定性的方法

利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。

利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。(2)利用文献保留值定性相对保留值r21：相对保留值r21仅与柱温和固定液性质有关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。（3）保留指数又称Kovats指数（Ⅰ），是一种重现性较好的定性参数。测定方法：将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原子个数乘以100（如正己烷的保留指数为600）。其它物质的保留指数（IX）是通过选定两个相邻的正构烷烃，其分别具有Z和Z＋1个碳原子。被测物质X的调整保留时间应在相邻两个正构烷烃的调整保留值之间如图所示：保留指数计算方法2.色谱定量分析方法(1)绝对校正因子在一定的色谱条件下，组分i的质量（mi）或其在流动向中的浓度，与检测器响应信号（峰面积Ai或峰高hi）呈正比：或mi=fiAAi

mi=fihhi式中fiA和fih是绝对校正因子。上述两式是色谱定量分析的依据。绝对校正因子受仪器及操作条件的影响很大，故其应用受到限制。在实际定量分析中，一般常采用相对校正因子。相对校正因子f

’i即组分的绝对校正因子与标准物质的绝对校正因子之比。当mi、mS以摩尔为单位时，所得相对校正因子称为相对摩尔校正因子,用（f’M）表示；当mi、mS用质量单位时,以（f’W）,表示。由于绝对因子很少使用，因此，一般文献上提到的校正因子，就是相