第十章 维生素的测定

重点维生素的分类、主要理化性质。维生素A、维生素B1、维生素C的测定方法。第十章维生素的测定

第一节概述

维生素既不是构成机体组织的基本原料，也不是机体的供能物质，它是一类需求量极少、人体不能合成（或合成量很少）、主要以辅酶的形式参与代谢调节，是维持人体正常生命活动所必需的天然有机化合物。目前已确认的有30余种，其中被认为至关重要的有20余种。这些维生素结构复杂，理化性质及生理功能各异，有的属于醇类，有的属于胺类，有的属于酯类，还有的属于酚或醌类化台物。VA17－脱氢胆固醇

生育三烯酚生育酚

β－胡萝卜素VA2维生素D3(胆钙化醇)

维生素分类：脂溶性（A、D、E、K）水溶性（B族、C）测定意义1、评价食品的营养价值；2、寻找富含维生素的食品资源；3、指导人们合理调整膳食结构，防止维生素缺乏症或维生素中毒；4、研究维生素在食品加工、贮存等过程中的稳定性，指导人们制定合理的工艺及贮存条件；5、监督维生素强化食品的强化剂量。食品分析的重要内容测定方法优点缺点生物鉴定法不用详尽分离费时费力微生物法选择性高，主要用于水溶性V操作繁琐，耗时过长紫外法、荧光法灵敏、快速、有较好的选择性柱、纸、薄层层析高分离效能，可分离、纯化、定性、定量高压液相色谱和气相色谱可同时完成多种V及其异构体的分离、检测比色法简便、快速、不需特殊仪器第二节脂溶性维生素的测定VA、VD、VE与脂类一起共存于食物中，摄食时可吸收，可在体内积贮。

脂溶性维生素具有以下理化性质：1．溶解性：不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。2．耐酸碱性：维生素A、D对酸不稳定，对碱稳定，维生素E对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。3．耐热性、耐氧化性：耐热性氧化性VA好，能经受煮沸易被氧化（光、热促进其氧化）VD好，能经受煮沸不易被氧化VE好，能经受煮沸在空气中能慢慢被氧化（光热碱促进其氧化）根据上述性质，测定脂溶性维生素时，通常：皂化样品水洗去除类脂物有机溶剂提取脂溶性维生素(不皂化物)浓缩溶于适当的溶剂测定。

在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂(如焦性没食子酸、维生素C等)。对于A、D、E共存的样品，或杂质含量高的样品，在皂化提取后，还需进行层析分离。一、维生素A的测定

维生素A存在于动物性脂肪中，主要来源于肝脏、鱼肝油、蛋类、乳类等动物性食品中。植物性食品中不含VA，但在深色果蔬中含有胡萝卜素，它在人体内可转变为VA，故称为VA原。样品→皂化（含Vc及内标物）→乙醚提取→水洗→挥去乙醚→乙醇溶解提取物→色谱分析C18反相柱分离，甲醇-水为流动相，紫外检测器，保留时间定性，内标法定量。（一）高效液相色谱法同时测定VA和VEP193-194

GB/T5009.82—2003中第一法

（二）比色法测定VA（GB/T5009.82—2003中第二法）

原理在氯仿溶液中，VA与三氯化锑可生成蓝色可溶性络合物，在620nm波长处有最大吸收峰，其吸光度与VA的含量在一定的范围内成正比，故可比色测定。测定步骤：①皂化：适量样品于三角瓶中→加10ml1∶1KOH及20-40ml乙醇→回流30min。②提取：皂化液移入分液漏斗，乙醚提取不皂化物。③洗涤：水洗、稀KOH洗、水洗至中性。④浓缩：醚层经无水Na2SO4滤入三角瓶中→回收乙醚至干→CHCl3溶解。⑤标准曲线绘制于数只3cm比色皿中分别加入1mlVA各标准系列液，各加1滴乙酸酐。在620nm处，以10mlCHCl3加1滴乙酸酐调零点，然后用注射器迅速加入9mlSbCl3-CHCl3溶液，于6s内测A（或最大值）。绘制曲线。⑥样品测定：取1ml样液，同上测A。该法的主要缺点是生成的蓝色络合物的稳定性差。比色测定必须在，否则蓝色会迅速消退，将造成极大误差。6秒钟内完成猪肝样品用研磨法注意：1.维生素A见光易分解，实验操作应在微弱光线下进行，或采用棕色玻璃避光。2.三氯化锑腐蚀性强，不能沾在手上，三氯化锑遇水生成白色沉淀．因此用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗。测定VA还有：紫外分光光度法（VA的异丙醇溶液在325nm下有最大吸收，可测低含量样品，干扰较多）荧光法

二、β-胡萝卜素的测定

（GB/T5009.83—2003）第一方法是HPLC；第二方法为纸层析法。胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的天然色素，有多种异构体和衍生物，总称为类胡萝卜素，其中在分子结构中含有β一紫罗宁残基的类胡萝卜素，在人体内可转变为维生素A，故称为维生素A原。如α、β、γ胡萝卜素，其中以β—胡萝卜素效价最高。

胡萝卜素原只存在于植物性食品中，但以含有胡萝卜为食物的家禽、兽类、水产动物及其加工产品，以及为着色而添加胡萝卜素的食品，当然也含有胡萝卜素。β—胡萝卜素的结构如下：胡萝卜素对热及酸、碱比较稳定，但紫外线和空气中的氧可促进其氧化破坏。因系脂溶性维生素，故可用有机溶剂从食物中提取。胡萝卜素本身是一种色素，在450nm波长处有最大吸收，故只要能完全分离，便可定性和定量。但在植物体内，胡萝卜素经常与叶绿素、叶黄素等共存，在提取β一胡萝卜素时，这些色素也能被有机溶剂提取，因此在测定前，必须将胡萝卜素与其它色素分开。常用的方法有纸层析、柱层析和薄层层析法。原理（纸层析法）：以丙酮和石油醚提取食物中的胡萝卜素及其他植物色素；以石油醚为展开剂进行纸层析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分离；剪下含胡萝卜素的区带、洗脱后于450nm波长下定量测定（总的）。脂肪含量高的先皂化三、维生素D的测定指含有抗佝偻病活性的一类物质。维生素D2无天然存在，维生素D3只存在于某些动物性食物中。但它们都可由维生素D原(麦角固醇和7一脱氢胆固醇)经紫外线照射形成。测定方法(一)三氯化锑比色法(二)高效液相色谱法灵敏度较比色法高30倍以上，且操作简便，精度高，是目前分析维生素D的最好方法。

第三节水溶性维生素的测定

水溶性维生素B1、B2和C，广泛存在于动植物组织中，饮食来源充足。但是由于它们本身的水溶性质，除满足人体生理、生化作用外，任何多余量都会从小便中排出。为避免耗尽，需要经常地由饮食来提供。

水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定，既使加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，特别在碱性条件下加热，可大部或全部破坏。它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响。维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏；维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。根据上述性质，测定水溶性维生素时，一般都在酸性溶液中进行前处理。维生素Bl、B2盐酸水解酶解

净化维生素C通常采用草酸、草酸—醋酸、偏磷酸—醋酸溶液直接提取。草酸价廉，使用方便，对维生素C有很好的稳定作用。淀粉酶、木瓜蛋白酶活性人造沸石、硅镁吸附剂一、维生素Bl的测定

维生素Bl又名硫胺素、抗神经炎素，通常以游离态，或以焦磷酸酯形式存在于自然界。在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色蔬菜和牛乳、蛋黄中含量较为丰富。分析方法：GB/T5009.84—2003中唯一的方法是荧光计法（书中介绍）。目前较先进简便的方法是高效液相色谱法原理：

硫胺素在碱性介质中可被铁氰化钾氧化产生硫色素，在紫外光照射下产生蓝色荧光，可借此以荧光比色法定量。λ

ex=365nmλem=435nm比较法定量见P197计算式步骤：P197二、维生素B2的测定

VB2即核黄素。在食品中以游离形式或磷酸酯等结合形式存在。膳食中的主要来源是各种动物性食品，其中以肝、肾、心、蛋、奶含量最多，其次是植物性食品的豆类和新鲜绿叶蔬菜。分析方法：GB/T5009.85—2003中第一法为荧光法。第二法为微生物法。HPLC简便、快速利用自身荧光微生物法原理：某一种微生物的生长（繁殖）必需某些维生素。例如干酪乳酸杆菌的生长需要核黄素，培养基中若缺乏这种维生素该细菌便不能生长。在一定条件下，该细菌生长情况，以及它的代谢物乳酸的浓度与培养基中该维生素含量成正比，因此可以用酸度及混浊度的测定法来测定试样中核黄素的含量。

三、维生素C的测定

维生素C是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以又称作抗坏血酸。维生素C广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、猕猴桃、柑桔等食品中含量尤丰富。

维生素C具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进一步水解则生成2，3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。食品分析中的所谓总抗坏血酸是指？(一)2，6—二氯靛酚滴定法

1．原理

还原型抗坏血酸可以定量还原染料2，6-二氯靛酚。该染料在酸性溶液中呈粉红色（在中性或碱性溶液中呈蓝色），被还原后颜色消失。还原型抗坏血酸还原染料后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准染料液的量，与样品中抗坏血酸含量成正比。还原型抗坏血酸染料(粉红色)脱氢抗坏血酸染料(无色)测定步骤：1.Vc标准溶液的配制2.Vc标准溶液的标定（用KIO3）3.样品溶液的制备（用草酸提取）4.靛酚的标定（用靛酚滴Vc标液）5.样品溶液的测定（用靛酚滴样液）6.计算标定：准确吸取Vc标准液5毫升于50毫升锥形瓶中，加入6%碘化钾溶液0.5毫升，1%淀粉溶液3滴，再以1.667×10-4mol/L碘酸钾标准溶液滴定，终点为淡兰色，按下式计算：抗坏血酸浓度（毫克/毫升）=V1——滴定时所耗1.667×10-4mol/L碘酸钾的毫升数0.088——1毫升1.667×10-4mol/L碘酸钾标准液相当于Vc的量（毫克/毫升）注意：①提取VC时（或配VC标液）加入H2C2O4溶液，其作用是防止VC氧化损失。因VC在酸性溶液中稳定（H2C2O4能抑制抗坏血酸氧化酶）。②提取时要尽量避光，避氧气进入，测定过程要迅速，以减少VC的氧化。③深色样液采用白陶土脱色（之前测回收率）。④如何减少样中其它还原性杂质的干扰？滴定样液时，滴加靛酚尽量地快，（一般杂质还原染料的速度比VC慢）。也可取样液加少量Cu2+，破坏VC，然后用染料滴定，扣除此校正值。(二)荧光法GB/T5009.86—2003第一