第二十一章microRNA检测技术在临床的应用

本章主要学习内容和要求主要学习内容要求

miRNA概念与特点

常用miRNA检测与定量的方法

掌握

第二十一章microRNA检测技术在临床的应用miRNA生物合成与功能miRNA检测在肿瘤诊断中的应用

熟悉了解miRNA检测在神经系统疾病诊断中应用

miRNA检测在心血管系统疾病诊断中应用

上一页下一页返回第一节概述

一、

miRNA概念与特点

(一)miRNA概念

miRNA是一类进化上保守的单链非编码小分子RNA，定位于RNA前体的3‘端或5’端，具有在翻译水平调控基因表达的功能。上一页下一页返回第一节概述

一、

miRNA概念与特点

（二）miRNA基本特征

1.结构特征

2.miRNA的存在形式

3.保守性

4.时空特异性上一页下一页返回第一节概述

一、

miRNA概念与特点

（三）不同生物的miRNA特点

植物与动物miRNA的区别

上一页下一页动物植物前体茎环结构短，简单长，复杂，折回长度变异明显加工过程先在细胞核内，后再细胞质仅在细胞核内作用机制大部分作为翻译阻遏子，小部分导致靶mRNAs的降解大部分介导靶mRNAs的降解长度21-23nt21nt保守性高更高返回第一节概述

一、

miRNA概念与特点

（四）miRNA与siRNA的比较

1.miRNA与siRNA相同之处（1）二者的长度都约在22nt左右。（2）二者都依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点:5＇端磷酸，3＇端均有2个游离核苷酸。（3）miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的。（4）二者都是RNA诱导的基因沉默复合体(RNAinducedsilencingcomplex，RISC)组分，都具有组成RISC复合体的Argonaute蛋白家族，其功能界限已变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠。上一页下一页返回第一节概述

一、

miRNA概念与特点

（四）miRNA与siRNA的比较

2.miRNA和siRNA区别：（1）根本区别是miRNA是内源的，在基因组中有固定的基因座位；siRNA可以是人工体外合成的，也可以是基因组的转录片断，降解片断和转座片断，病毒基因组转录片断等，。（2）二者结构上没有本质区别，功能分子都是单链RNA，miRNA转录出来时必然是发夹状的，siRNA可以由完全互补的双链切断而来，也可以从发夹来。（3）本质区别在于作用位点上，miRNA作用于固定的靶基因，有特定的作用位点，一般在靶基因3′-UTR区，而siRNA由于是随机产生的或者人工设计的，因此作用位点可以设计或改变，可作用于mRNA的任何部位。（4）在作用方式上，没有本质区别，是否降解或翻译抑制取决于互补程度，siRNA也可抑制靶标基因的翻译。（5）miRNA的生理功能在于调控发育分化和调亡，适时调节内源基因表达，而siRNA是生物抵抗外来核酸片断入侵的一种方式，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。上一页下一页返回第一节概述二、miRNA生物合成与功能（一）miRNA生物合成

上一页下一页1miRNA生物合成过程

在细胞核内，基因组DNA转录生成较长的RNA分子（可长达1000nt），被双链RNA特异的核糖核酸酶Drosha

切割成长度大约70-100碱基的、具发夹结构的RNA分子（前体microRNA）。这些发夹结构的RNA通过核输出蛋白exportin5机制转运到细胞质，然后被第二个双链RNA特异的核糖核酸酶Dicer切割，得到19-23nt大小的成熟的miRNAs

产物。返回第一节概述二、miRNA生物合成与功能（一）miRNA生物合成

上一页下一页

miRNA生物合成过程

返回第一节概述二、miRNA生物合成与功能（一）miRNA生物合成

上一页下一页2miRNA在基因组分布

独立表达的miRNAs

成簇表达的miRNAs

位于内含子的miRNAs

返回第一节概述二、miRNA生物合成与功能（二）miRNA

生物学功能1.miRNA调控基因表达机制上一页下一页miRNA调控基因表达两种机制miRNA调控蛋白翻译

miRNA调控mRNA降解返回第一节概述

二、miRNA生物合成与功能（二）miRNA

生物学功能

2.miRNA调控基因表达的特征与优点（1）miRNA调控基因表达的特点

1）交叉调节;2）自我调节;3）可逆性调节.（2）miRNA调控基因表达的优点

1）与蛋白水平的调节相比，更加节省能量

2）与转录水平调节相比，miRNA

调节更迅速，而且是可逆的

3）内含子所编码的miRNA

是一种对基因组资源的高效利用上一页下一页返回第一节概述三．miRNA应用（一）基因功能的分析（二）miRNA

功能和效应的评价（三）新型基因治疗方案的设计和发展（四）抗病毒疫苗的设计和研制（五）功能缺失转基因动物的建立上一页下一页返回第二节miRNA检测与定量方法一、理想的miRNA检测与定量方法miRNA检测

1.具有足够的灵敏性检测到少量的miRNA；

2.具有足够的特异性足以分辨一个碱基差异的

miRNA；

3.能够进行miRNA表达的定量分析；

4.进行多样本平行检测；检测过程简便、经济。上一页下一页返回第二节miRNA检测与定量方法二、几种常用miRNA检测与定量的方法（一）基因芯片技术

miRNAmicroarray可以检测组织特异的miRNA,并且实验结果可重复率高。这种微芯片不仅可以检测miRNA的类型,还可以对其进行定量。它可以一次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达;通过设计适当的寡核苷酸探针,同时检测成熟的miRNA及其前体分子;miRNAmicroarray可以用于高通量的筛选miRNA,并且可以用于临床病例的筛选。

上一页下一页返回第二节miRNA检测与定量方法二、几种常用miRNA检测与定量的方法（一）基因芯片技术上一页下一页基因芯片技术检测miRNA表达的基本原理返回第二节miRNA检测与定量方法二、几种常用miRNA检测与定量的方法（二）荧光定量技术实时定量逆转录PCR可用于检测miRNA的表达水平。Step-loop实时定量是一项高特异度、敏感度的检测miRNA表达的实验技术，包括设计具有茎环（stemloop）结构的反转录引物和用miRNA荧光标记的特异分子探针进行实时PCR2个关键步骤。该技术有以下优点：高度特异性，特异的step-loop反转录引物和探针确保反应不受其前体及基因组DNA污染等因素的干扰，对序列高度同源的miRNA也可精确区分；超宽的定量线性范围和高度的检测灵敏度，从几个拷贝到几万个拷贝，定量线性范围跨越7个数量级

上一页下一页返回第二节miRNA检测与定量方法Step-loop反转录PCR检测miRNA基本原理上一页下一页返回第二节miRNA检测与定量方法二、几种常用miRNA检测与定量的方法（三）克隆测序技术大多数现有的miRNA是通过cDNA克隆识别和鉴定出来的,这是发现miRNA的重要方法。构建miRNA的cDNA文库通常有两种方法,

一种是将所有的RNA通过变性聚丙烯酰氨凝胶电泳分离回收25nt以下的小片段RNA,随后在RNA3′和5′端连上接头,逆转录后与对应引物进行PCR扩增,再将片段克隆至载体,最后对每个克隆进行测序。第二种方法是分离出小片段RNA后,用poly(A)聚合酶在3′端进行多聚腺苷酸化反应,逆转录后,再在cDNA3′端进行鸟苷酸化反应,随后进行扩增和测序,最后通过PAGE/Northernblot等予以验证。

上一页下一页返回第二节miRNA检测与定量方法

上一页下一页克隆测序技术进行miRNA检测的基本原理返回第二节miRNA检测与定量方法二、几种常用miRNA检测与定量的方法

（四）原位杂交技术原位杂交(Insituhybridization)检测miRNAs逐渐发展起来,它可以检测候选miRNAs的短暂表达。应用原位杂交技术可进行石蜡包埋、福尔马林固定的组织内的miRNA检测，同时可以不再分离miRNA情况下，进行多细胞之间miRNA表达的检测。

上一页下一页返回第二节miRNA检测与定量方法上一页下一页原位杂交方法检测miRNA的基本原理返回第二节miRNA检测与定量方法二、几种常用miRNA检测与定量的方法（五）Northern杂交技术

RNA印迹即Northernblot是最经典的检测真核生物RNA的量和大小及估计其丰度的实验方法,可以从大量的RNA样本中同时获得这些信息,主要包括:①完整的RNA的分离;②根据RNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳对RNA进行分离;③将RNA转移到固相支持物上,在转移过程中,要保持RNA在凝胶中的相对分布;④将RNA固定到固体支持物上;⑤固相RNA与探针分子杂交;⑥除去非特异结合到固相支持物上的探针分子;⑦对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析。

上一页下一页返回第二节miRNA检测与定量方法上一页下一页Northern杂交技术进行miRNA检测的基本原理图返回第三节miRNA检测的临床应用上一页下一页一、miRNA检测在肿瘤诊断中的应用

最近的研究发现，miRNA表达与多种癌症相关，大约50%得到注解的miRNAs在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点（fragilesite）。这说明miRNAs在肿瘤发生过程中起至关重要的作用，这些miRNAs所起的作用类似于抑癌基因和癌基因的功能，有研究人员将miRNA命名为“ONCOMIRs”。对患者进行的有关oncomiR的大型高通量研究，可以对癌症进行新的分类，并对患者预后做出更为准确的预测。

返回第三节miRNA检测的临床应用上一页下一页一、miRNA检测在肿瘤诊断中的应用（一）microRNA与癌症产生

MicroRNAs诱发肿瘤的机制返回第三节miRNA检测的临床应用上一页下一页一、miRNA检测在肿瘤诊断中的应用（二）oncoMIR的表达情况与人类多种恶性肿瘤的发生、发展、诊断、预后相关研究

miRNA

表达水平的变化,导致了肿瘤基因或抑癌基因转录后的异常调控,从而导致肿瘤的发生。通过寻找具有癌基因和抑癌基因性质的miRNA,可以为肿瘤的诊断和生物治疗提供新的靶标。返回第三节miRNA检测的临床应用上一页下一页各种肿瘤组织内miRNA表达以及与预后的相关性

肿瘤类型miRNAS表达情况检测方法与预后的关系脑肿瘤miR-21升高Northern杂交不清楚miR-221，miR-10b升高芯片杂交Northern杂交miR-128，miR-181a降低芯片杂交Northern杂交乳腺癌miR-21升高芯片杂交Northern杂交miR-21与miR-145表达水平与肿瘤增殖指数具有相关性miR-125b,miR-145降低芯片杂交Northern杂交结直肠肿瘤miR-143，miR-145miR-133b降低Northern杂交miR-31表达水平与肿瘤的分期有关miR-31,miR-95,miR-135b,miR-183升高定量PCR检测返回第三节miRNA检测的临床应用上一页下一页各种肿瘤组织内miRNA表达以及与预后的相关性

肿瘤类型miRNAS表达情况检测方法与预后的关系非小细胞肺癌let7降低芯片杂交定量PCR检测Let7的低表达与miR-155高表达预示预后不佳miR-126降低芯片杂交定量PCR检测miR-21，miR-205，miR-155升高芯片杂交定量PCR检测肝细胞肿瘤miR-18，miR-224升高芯片杂交Northern杂交miR-18表达水平与肿瘤分化成负相关miR-199a,miR-195,miR-200a,miR-125a降低芯片杂交Northern杂交甲状腺滤泡癌miR-197,miR-346升高芯片杂交定量PCR检测生殖细胞肿瘤miR-372,miR-373升高原位杂交返回第三节miRNA检测的临床应用上一页下一页二、miRNA检测在心血管系统疾病诊断中应用

目前有关miRNA在心脏病理生理过程的调节作用的研究已经取得一些进展。在心脏的发生发育与分化的调节方面，小分子RNA能帮助精确调节与心脏肌肉初期发育有关的关键蛋白的生产；如miR-1能够靶向Hand2基因的mRNA，而Hand2基因是心脏形成的一种关键调节因子。小分子RNA适时地关闭Hand2蛋白的生成以促使心肌正常发育。同时，miR-1也是肌细胞的分化调节因子的直接作用靶点。研究发现，在心脏的肥大过程中，miR-19