外源基因在小鼠体内的表达

外源基因在小鼠体内的表达1980年至1982年三年的时间里，外源蛋白在小鼠体内表达的概念从一个想法变成现实。在此期间几个实验室致力于引入新的基因和外源表达蛋白，首先是在小数的胚胎十细胞内，其次是成熟的小鼠体内。拉尔夫Brinster和理查德Palmiter是这一领域的先驱。在1981年，他们首次演示了病毒基因在小鼠体内的表达。背景：用一个有效的方法来研究基因和控制他所编码的蛋白在细胞和整个生物体的表达。DNA重组技术问世之前，生物学家通过将外源的mRNA注入青蛙的卵母细胞来研究mRNA所编码蛋白的生物活性。分子生物学革命使得基因被融合到特意的启动子上，从而使他们在所需的细胞系内表达。使得生物学家可以研究人工培养细胞的基因的功能，他们甚至想研究活机体的基因。这需要特定外源基因在胚胎肝细胞内的表达，将外源基因引入到动物基因组中，并检测其在生物体内的功能。在1970s初期，Brinster表明，外源基因可以通过将癌细胞注射到中年鼠的由早期囊胚形成的胚胎干细胞内，使其在小鼠体内表达的方法来实现。然而这种方法使得外源基因在所需的细胞类型中表达是非常困难的。这需要将外源基因导入小鼠的基因组内。1980年生物学家表明可以将含有DNA的病毒质粒注入到小数的受精卵中，然后检测新生小鼠中的病毒序列。这个实验是确定外源基因整合到小鼠基因组中形成的功能性蛋白能否表达。实验：Brinster的挑战是设计这样一个方案，设计一个简单明了的实验证明外源蛋白存在于小鼠内。要做到这一点，Brinster选择了一个表达容易测定的酶，而不是他的具有生物学意义的第一只转基因小鼠的蛋白，他选择的是单纯疱疹病毒(HSV)的酪氨酸激酶，这个选择有几个优点，首先，这个基因来源于人类病毒，其序列与小鼠的内源基因不同，可以更容易的整合的小鼠的基因组中。其次磷酸酪氨酸激酶可以根据放射性标记的胸腺嘧啶脱氧核苷转化为胸苷一磷酸来测定。最后HSV的胸苷激酶活性的抑制剂不能抑制小鼠内源酶的活性。使得研究人员能够明确的检测外源蛋白的活性。基因结合在蛋白编码区DNA序列的上游的启动子区被表达的，启动子能够控制何时、何地的基因被表达，病毒基因在小鼠体内的表达需要生物学家去除启动子控制区的基因，并使病毒基因去启动子融合且在小鼠细胞内具有活性。Brinster与Palmiter合作，研究了小鼠小鼠金属硫蛋白-1(MT-1)基因的启动子，Palmiter将HSV胸苷激酶基因融合到小鼠金属硫蛋白-1(MT-1)基因的启动子上，这样可以确认是否一个外源蛋白能在小鼠体内表达。为了产生一个转基因小鼠，Brinster与Palmiter将含有HSV胸苷激酶和MT-1启动子融合基因的质粒注射到小鼠受精卵的细胞核中，再将其植回到雌性小鼠体内，科学家使其与正常的小鼠交配，并分析子代小鼠中含HSVDNA量和胸苷激酶的活性。用Southern印迹分析，他们检测了MT-1启动子/胸苷激酶融合基因，被称为转基因。他们分离出基因组DNA，然后用限制性核酸内切酶切割，根据切割的DNA片段的大小利用琼脂糖凝胶电泳进行分离，并转移到硝酸纤维素膜上，两个科学家后用杂交放射性标记的探针对膜进行分析。分析显示，该基因已被成功地整合到四个子代小鼠的基因组中。接着，为了确定转基因是否表达了功能性蛋白，Brinster和Palmiter在小鼠MT-1高表达的肝脏匀浆中分析胸苷激酶的活性，该小鼠肝组织匀浆含有比

其同窝小鼠的肝组织匀浆约200倍以上的胸苷激酶活性。这只小鼠是转基因整合到基因组中的四只中的一只。为了证明这种活性的增加是病毒胸苷激酶表达的结果，他们利用抑制剂作用于肝脏匀浆，特异性的阻断了HSV胸苷激酶的活性。抑制剂作用后转基因小鼠肝脏匀浆中胸苷激酶的活性显著降低，而没有转基因的小鼠肝脏匀浆中的激酶的活性没有改变。（表8.1）从而Brinster和Palmiter证实病毒胸苷激酶活性的存在，并表明外源蛋白可以在小鼠体内表达在小鼠。|ExpressionofViralThymidineKinaseinTransgenicMiceMouseTransgencDNAThymidineKinaseActivity—Inhibitor-I-Inhibitor—Inhibitor-I-Inhibitor23-123-21450023-123-214500497,000[AdaptedfromR.L.Brinsteret1981,Ceti27:223-231.]讨论，研究人员尝试外源蛋白在动物体内的表达在胚胎学和分子生物学中的进展已经相当成熟，BrinsterandPalmiter仔细选择容易测定的HSV胸苷激酶基因放置在金属硫蛋白启动子的控制下，说明了这种技术的可行性。转基因小鼠的产生使得基因功能研究变的生动可贵。在此