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文档简介

第七章酶(蛋白质)的基因水平分子改造(蛋白质工程)基因水平的蛋白质分子改造是采用定点突变对蛋白质编码基因进行改造,改变蛋白质的氨基酸获得具有预期性状的蛋白质。突变酶新酶克隆酶分子设计第一节概述一、基因水平分子改造的基本程序第一,分离纯化需改造的目标蛋白;第二,目标蛋白的序列分析、结构分析和功能分析;第三,分子设计和结构预测(计算机模拟);第四,分离克隆目标蛋白的编码基因;第五,基因定点突变;第六,突变基因的表达载体构建与表达第七,突变蛋白的分离纯化与功能检测二、基因水平分子改造的基本内容①改变酶促反应的Km与Vmax,可改变反应的催化效率;②改变蛋白的pH值或温度稳定范围,可改变蛋白的作用条件;③改变蛋白在非水溶剂中的反应性,可使蛋白在非生理条件下作用;④改变某种酶,使其不再需要加入辅助因子,简化持续生产过程;⑤提高酶对底物的亲和力,以增强酶的专一性,减少不必要的副反应;⑥增强蛋白对胞内蛋白酶的抗性,可简化纯化过程,提高产率;⑦改变酶的别构调节部位,减少反馈抑制,使产物的产率提高;⑧提高蛋白的抗氧化能力;⑨根据需要改变酶的底物专一性;⑩改变蛋白发生作用的种属特异性。第二节蛋白质的结构和功能分析一、蛋白质结构分析蛋白质数据库(ProteinDataBank,PDB)已收集了数万个蛋白质的晶体结构。

对于PDB中没有收录或未见文献报道的蛋白质,其结构分析可通过以下方法获得:

晶体学技术:x射线晶体技术、中子衍射技术、电子晶体技术——蛋白质晶体构象

波谱学技术:多维核磁共振(NMR)、电子自旋共振——蛋白质溶液构象

蛋白质结构预测:根据蛋白质的氨基酸序列构建出蛋白质的立体结构模型。二、蛋白质功能分析生理功能的测定活性位点的测定作用条件的测定根据已知结构信息化学修饰和突变方法根据蛋白质同源性第三节酶(蛋白质)的分子设计酶(蛋白质)分子设计就是以酶(蛋白质)结构预测为基础设计一个针对性地改造酶(蛋白质)分子的方案。一、分子设计的类型基于天然蛋白质的分子设计全新蛋白质设计小改设计(1或几个aa替换、删除、插入)中改设计(一个肽段或一个结构域)大改设计(从头设计)二、分子设计的原理

1、内核假设内核是指蛋白质在进化中保守的内部区域。内核由氢键连接的二级结构单元(α螺旋或β折叠)组成,氢键都是最大化的。内核都是致密堆积的疏水区(很少有空穴大到可以结合一个水分子或惰性气体),并且没有重叠。

2、疏水或亲水氨基酸需要合理地分布疏水性氨基酸通常出现在蛋白质的活性中心区域;环区、转角区和带电荷区通常位于蛋白质的表面,或在底物结合区和配基结合区。

3、注意保留脯氨酸、半胱氨酸残基

脯氨酸是终止α螺旋区,两半胱氨酸常形成起稳定作用的二硫键。

4、注意保留活性中心区的保守氨基酸残基

5、注意保留潜在的N糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr-X-Pro)中的Asn、Ser或Thr。

6、在金属蛋白中,配位残基的替换要满足金属配位的几何要求(键长、键角)三、分子设计的程序

1、以蛋白质的三维结构为基础,利用计算机模拟技术确定突变位点及替换的氨基酸;

2、利用能量优化及蛋白质动力学方法预测改造后的蛋白质结构;

3、预测的结构与原始的蛋白质结构比较,利用蛋白质结构-功能或功能-稳定性相关知识及理论计算,预测新蛋白质可能的性质和功能。第四节基因定点突变寡核苷酸介导法

PCR突变法盒式突变法

DNAshuffling(结构域互换、片段重组)一、寡核苷酸介导法

寡核苷酸介导法是指通过突变寡核苷酸引物在DNA合成中引起目的基因特定位点发生核苷酸插入、缺失或取代等突变。1、原理与程序测序验证及突变基因片段回收表达载体构建突变蛋白的表达分离纯化及功能分析

2、突变寡核苷酸引物的设计原则

①必须与模板链上的目标DNA序列互补;

②必须足够长以便特异地与目标DNA序列退火;单个核苷酸改变:17nt~19nt

两个以上毗邻核苷酸改变:>25nt③突变核苷酸应位于引物中央;

④应避免可形成稳定二级结构;

⑤不能同模板的非突变区段形成稳定的杂交体。

3、具体操作方法

①单引物法

突变引物②双引物法突变引物、通用的测序引物以上两种方法的突变率只有1%~5%

③Kunkel突变法双引物、dU-模板,突变率达80%以上UUUUUUUUUUUUUUUUUU3’5’Pung-:尿嘧啶-N-糖基化酶缺陷

dut-:dUTP酶缺陷转染野生型株系模板链降解Kunkel方法宿主:E.coli

CJ236品系(dut-ung-)关键技术:制备高质量的含U的单链DNA模板二、PCR突变法

利用PCR技术在体外进行定点突变,可使突变体大量扩增,提高突变效率。

1、产生取代突变的PCR突变法

2、产生插入突变的PCR突变法

3、产生缺失突变的PCR突变法三、盒式突变法(片段取代法)

利用DNA体外重组技术将一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片断取代目标基因中的相应序列。四、DNAshuffling优点缺点盒式突变法简单,突变效率高靶DNA区段两侧需存在1对限制酶单一切点寡核苷酸介导法较简单重组子筛选难PCR突变法突变效率100%扩增产物需连接到载体上;TaqDNA聚合酶拷贝的保真性第五节提高酶(蛋白质)的应用性①提高酶的活性

②提高酶的稳定性(耐热、抗氧化)

③改变酶的底物专一性

④改变酶的最适pH

⑤改变酶对辅酶、辅基的要求

⑥改变酶的别构调节功能

⑦提高药用蛋白的保存期⑧提高药用蛋白的药效一、提高T4溶菌酶的热稳定性(引入二硫键)具有二硫键的蛋白一般不易去折叠,热稳定性较高,且这种蛋白往往在有机溶剂或非正常生理条件(如极端pH值条件)下也不易变性。酶半胱氨酸的位置和数目二硫键数目相对活性%Tm/℃野生型酶Cys54、Cys97无10041.9突变酶ACys3、Cys9719646.7突变酶BCys9、Cys164110648.3突变酶CCys21、Cys1421052.9突变酶DCys3、Cys9、Cys97、Cys16429557.6突变酶ECys9、Cys21、Cys142、Cys1642058.9突变酶FCys3、Cys9、Cys21、Cys97、Cys142、Cys1643065.5二、提高酵母磷酸丙糖异构酶的热稳定性

在高温条件下,Asn与Gln容易脱氨而变成Asp与Glu,这种改变有可能导致肽链的局部构象发生改变,从而使蛋白失活。

酶氨基酸及其位置半寿期min野生型酶Asn14、Asn7813突变酶AAsn14、Thr7817突变酶BAsn14、Ile7816突变酶CThr14、Ile7825突变酶DAsp14、Asn7811三、提高重组β干扰素的专一活性和贮存稳定性

重组β干扰素的抗病毒活性只有天然的10%,其原因是一些重组β干扰素形成了无活性的二聚体或寡聚体。

β干扰素有3个Cys,Cys31和Cys141形成分子内二硫键,带有游离巯基的Cys17形成分子间二硫键。

Cys17→Ser17,突变重组β干扰素的抗病毒活性提高到了100倍,与天然β干扰素相比其贮存稳定性大大增强。四、提高α1抗胰蛋白酶的抗氧化性

α1抗胰蛋白酶对嗜中性白细胞弹性硬蛋白酶的抑制机理:α1抗胰蛋白酶与嗜中性白细胞弹性硬蛋白酶迅速结合,并切断α1抗胰蛋白酶Met358和Ser359之间的肽键,形成更加稳定复合体。氧化作用可使α1抗胰蛋白酶的Met358转变为甲硫氨酸亚砜,不被嗜中性白细胞弹性硬蛋白酶切割,其抑制作用极差。

Met358→Val358,α1抗胰蛋白酶的抗氧化能力增强。五、改变枯草杆菌蛋白酶的动力学活性酶第222位氨基酸KcatKm野生型蛋白酶Met501.4×10-4工程蛋白酶ACys844.8×10-4工程蛋白酶BSer276.3×10-4工程蛋白酶CAla407.3×10-4工程蛋白酶DLeu52.6×10-4

在lmol/L双氧水环境中那些突变成不能氧化的氨基酸(如Ser、Ala或Leu)的酶仍保持活性,而野生型酶和替换成Cys的突变酶则很快就失活了。

六、改变枯草杆菌蛋白酶的最适pH

将枯草杆菌蛋白酶活性中心附近的一个Asp突变成Ser后,枯草杆菌蛋白酶的最适pH值下降了0.3个单位。七、提高水蛭素的凝血酶抑制活性

把47位的Asn变成Lys或是Arg时,它在试管中的抗凝血效率提高了4倍,是一种效果更强的抗凝血剂。在动物上检验其抗血栓形成的效果,发现其效率提高了20倍,甚至比肝素都高5倍。八、提高酪氨酰-tRNA合成酶的活性突变氨基酸KcatKmKcat/KmThr51

(野生)4.72.51.860Ala514.01.2

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