生化分离实验蛋白质

过氧化氢酶的分离纯化鉴定过氧化氢酶又称触酶，是一类广泛存在于动物内脏，植物和微生物体内的末端氧化酶。过氧化氢酶专一分解过氧化氢，溶于水，几乎不溶于乙醇，氯仿，乙醚。过氧化氢酶是在生物演化过程中建立起来的生物防御系统的关键酶之一，其生物学功能是催化细胞内过氧化氢分解，防止脱脂过氧化。迄今为止，过氧化氢酶已经成为农业，食品业，乳制品业，纸浆和造纸业，以及农业环保产业中有应用价值的酶之一。实验背景实验原理匀浆使细胞破碎，让细胞中的蛋白质释放。用重金属盐沉淀，高速离心使产物与杂蛋白分离。凝胶柱利用凝胶粒子为固定相，根据料液中溶质相对分子质量的差别分离出所需的蛋白质。再用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据蛋白质的相对分子质量不同移动速度也不同，检验得到蛋白质的相对分子质量。最后用Folin-酚试剂法测蛋白质的浓度。实验步骤1.粗酶的提取2.初步分离纯化3.进一步分离纯化4.过氧化氢酶鉴定粗酶的提取将10克的猪肝用剪刀剪碎，以料水质量比1:5的比例加水研磨，在高速匀浆机的作用下将其打成肝糜，用高速离心机12000rpm下离心15min，取上清液，即为粗酶液。初步分离纯化在粗酶液中缓慢加入硫酸铵粉末，配制为30%的溶液，用玻璃棒搅拌15min。再在高速离心机中12000rpm下离心15min，取上清液。将得到上清液放入盐析袋中盐析过夜。将盐析袋置于搅拌子匀速搅拌的装有蒸馏水的大烧杯中盐析。盐析时间为一夜。（使之盐析充分）盐析袋使用前需检漏。进一步分离纯化由于盐析后的溶液中仍含有大量的杂蛋白，为防止杂蛋白堵塞S200凝胶柱，进样前先进行一次抽滤。将抽滤所得液体进样到S200凝胶柱中分离，设流速为1ml/min,压力为0.5帕。收集峰上的溶液。抽滤设备S200凝胶柱出峰位置图（蓝线）0.00mlMethodRun2013-10-29,9:55:42,Method:,Result:c:\...\prime\ManualRuns(prime)\ManualRun0.RES0.00mlBaseTime{}0.00mlPause0.02013-10-29,9:55:42(Manual)0.00mlError:62CheckthattubepositionisOK0.00mlConcentration0%B0.00mlContinue2013-10-29,9:55:45(Manual)0.00mlFlow2.0ml/min11.72mlPause0.02013-10-29,10:01:37(Manual)11.72mlFlow0.0ml/min11.72mlContinue2013-10-29,10:01:51(Manual)11.72mlFlow2.0ml/min17.96mlPause0.02013-10-29,10:04:58(Manual)17.96mlFlow0.0ml/min17.97mlContinue2013-10-29,10:05:20(Manual)17.97mlFlow2.0ml/min116.74mlFractionsize3.0ml222.89mlFractionOff过氧化氢酶的鉴定SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：制胶，将粗酶，硫酸铵沉淀后的酶液，凝胶柱分离后的溶液分别与溴酚蓝以1:1比例混合沸水加热5min制成样品。将3个样品及mark加样至凝胶中，跑电泳，染色，脱色后观察。

垂直板电泳装置加样样品迁移方向标准蛋白质与待测样品电泳图谱144002500045000662001160009号峰上液体4号峰上液体3号峰上液体标准蛋白mark其它峰未跑出条带条带顺序：过氧化氢酶经查资料得其相对分子量为57000KDFolin-酚试剂法测蛋白质浓度：标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于500nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线。样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。分光光度计蛋白质浓度（ug/ml）03.857.6915.3823.0830.7738.46吸光度00.0380.0750.1060.1820.2580.308经过电泳得出的条带我们可以看出过氧化氢酶酶可能存在于3,4,9号峰中，所以我们取粗酶，3号峰、4号峰、9号峰的酶液做蛋白质浓度测定。A粗酶=1.499经标准曲线对照粗酶187.075ug/mlA3=0.174计算得蛋白质浓3号峰21.45ug/mlA4=0.185