现代分子生物学技术基础之 DNA、RNA的分析及转录调控分析技术

现代分子生物学技术基础

DNA、RNA的分析及转录调控分析技术

斑点杂交

Southern印迹杂交一核酸杂交Northern印迹杂交

基因芯片等

变性梯度凝胶电泳(DGGE)二突变筛查技术单链构象多态性(SSCP)

变性高效液相色谱（DHPLC）化学切割错配（CCM）蛋白质短截检测（PPT）等三DNA测序

四转录调控分析一、核酸杂交

用标记的核酸探针鉴定复杂核酸分子中密切相关的DNA、RNA的方法。

主要涉及技术：斑点杂交：

Southern印迹杂交

Northern印迹杂交原位杂交

DNA微阵列技术

1核酸杂交的概念和基本原理将标记的核酸探针变性，与变性后的靶DNA/RNA通过硷基互补配对结合，形成杂种分子的过程。其目的是鉴定分析复杂的靶DNA/RNA中与探针同源的核酸片段。

2核酸探针（nucleicacidprobe）1）概念:核酸探针：是指与目的基因或DNA/RNA特异互补的一段核酸片段。探针可是单链或双链，但工作的探针必须为单链。2）种类：

DNA探针

cDNA探针

RNA探针

3）探针标记：将探针标记上一种标识物以便于杂交后检测。

（1)常用的标识物及检测：同位素：32P

,35S

,3H-dNTP等；检测方法：放射自显影优点：灵敏度较高不足：放射性物质容易衰变；且易导致放射污染

非同位素：标记物：地高辛-dUTP，生物素-dUTP。检测方法:非同位素标记的探针经显色或化学发光法等检测优点:无放射污染,保存时间较长缺点:

灵敏度较低10①

缺口平移法（NickTranslation）原理及过程：反应体系中DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口；DNA聚合酶I具有5′→3′外切酶活性，在缺口处按5′→3′方向切除单核苷酸；DNA聚合酶I还具有5′→3′聚合酶活性，在缺口处3′端加入底物中单核苷酸，弥补缺口处核苷酸链。随反应进行，底物中被标记单核苷酸随机掺入。DNA聚合酶I两种作用交替进行，探针即被标记。（2）探针标记主要方法

NickTranslationOHpOH+PPDNAdNTP，DNA酶I，DNA聚合酶I32P-dNTPBio-dNTP12②.随机引物法（六核苷酸引物标记法）

原理及过程：利用E.coliDNA聚合酶I的Klenow亚单位，合成含有标记核苷酸的DNA链。Klenow具有5′→3′聚合酶活性。待标记DNA（探针）变性成单链，引物与模板结合。在Klenow酶催化下，按5′→3′方向合成DNA新链。反应体系中含有标记的dNTP,随机掺入新合成DNA链中，探针被标记。③

应用多聚核苷酸激酶进行DNA末端标记：常用于寡核苷酸探针的标记。根据已知基因序列合成一段长约15-50个bp的核苷酸探针。

多聚核苷酸激酶能将dATPγ位的同位素32P置换DNA5′端的P。。④其他：

填充末端标记法等1）

斑点杂交：获取靶DNA（如人类全基因组DNA）的溶液，点样于一硝酸纤维素膜或尼龙膜上，干燥、固定、杂交。

靶DNA序列的变性：点样前热处理或点样后碱溶液处理。

3核酸杂交的主要方法

等位基因特异性寡核苷酸探针杂交（allele-specific-oligonucleotide,ASO）

适用于基因突变部位和性质已完全明确的突变检测。合成ASO探针，大小20bp左右，标记后用于杂交检测。检测点突变时一般需合成两种探针：设计：正常探针：只与正常基因序列杂交形成稳定杂交体突变探针：只与突变基因序列杂交稳定杂交体

PCR技术可结合ASO，即PCR-ASO技术，以ASO探针检测扩增后产物——突变基因检测。2

）Southern和Northern印迹杂交

通过凝胶电泳按片段大小分离核酸,然后检测：为核酸杂交的主要方法

（1)Southern印迹杂交

因EdwinM.Southern建立的技术而命名,用于鉴定DNA片段的分子杂交技术。1)原理：碱基互补2)步骤：

DNA提取：提取组织或细胞的基因组DNA

DNA分离：限制酶消化DNA，凝胶电泳分离大小不同的DNA片段Southern印迹杂交DNA变性：凝胶中的DNA在碱性溶液中变性转膜：将变性的DNA片段从凝胶原位转移印迹在硝酸纤维素膜或尼龙膜上。杂交：将标记的探针变性，同固着的靶DNA片段杂交，与靶DNA中的互补DNA序列形成异源双链。Southern印迹杂交洗膜：未结合的多余DNA探针以及非特异性结合的DNA探针通过洗膜去除放射自显影：将杂交的膜进行放射自显影。结果分析：依杂交信号在膜上的位置判定DNA大小、信号强度推测DNA拷贝数22-+Southernblot探针

应用：基因的定性及定量分析(2)基因突变分析:缺失、插入,影响到酶切位点的点突变

(3)RFLP连锁分析（2）Northern印迹杂交是一种类似Southern印迹杂交用来鉴定特定mRNA的方法，可以获得特异基因表达的信息。基本原理与Southern印迹杂交一致，只是靶核酸为RNA。步骤：RNA提取：从待测组织或细胞提取总RNA或mRNARNA分离：甲醛变性凝胶电泳按照分子量大小分离RNA转膜：RNA从凝胶转移到膜上杂交：用标记的特异基因探针检测待测组织或细胞中该基因表达情况洗膜:去除未结合及非特异性结合的探针

应用

（1）检测mRNA分子大小（依杂交带位置）（2）mRNA的含量，即基因表达水平高低（依杂交带密度）

3)原位杂交

（1）染色体原位杂交：利用一个标记的DNA探针与已经原位变性的染色体DNA杂交。常用的技术为荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization，FISH)基本原理：应用地高辛或生物素标记探针DNA，变性成单链后与变性后的染色体或细胞核靶DNA杂交。在荧光显微镜下观察并记录结果应用：①基因定位②检测染色体的数目和结构异常,进行遗传病的诊断和产前诊断（2）组织原位杂交：利用一个标记的探针与组织切片上的RNA杂交。组织切片可由石蜡包埋或冰冻切片（3）整装原位杂交（wholemountinsitu）：在一个完整胚胎中研究基因表达

DNA微阵列(DNAmicroarrays)技术:反向核酸杂交方法。

4)DNA微阵列基因芯片（又称DNA芯片，DNA微阵列），在一固体支持物上集成了大量密集、有序排列的基因探针，也称微阵列.与样品中同源核酸分子通过碱基互补配对进行杂交，实现生物基因信息的高通量检测。同步比较分析成千上万基因的信息，对揭示生命现象的规律具有重要作用。已成为当前生命科学研究的热点之一。36基因芯片的应用：1、基因表达分析2、基因变异筛查：

单核苷酸多态性（SNP）

突变检测等二突变筛查技术1

变性梯度凝胶电泳

2

单链构象多态性３变性高效液相色谱

4等位基因特异性PCR

５蛋白质短截检测６化学切割错配1变性梯度凝胶电泳（Denaturringgradientgelelectrophoresis,DGGE）：基本原理：不同DNA序列开始变性时对变性剂浓度的要求不同，利用变性剂浓度呈梯度增加的凝胶来分离DNA片段的凝胶系统。

在变性剂梯度由低到高的聚丙烯酰胺凝胶电泳中，对变性剂浓度要求较低的DNA片段先部分解链，电泳速度减慢；与后解链片段的电泳迁移速度产生差异，电泳带位置不同，可将正常和突变DNA进行分离

为使DNA片段在变性梯度凝胶电泳中保持部分解链，避免完全解链所致的片段长度决定迁移，常在引物5′端增加40bp的GC重复序列（即GC夹）。DGGE与PCR结合---PCR-DGGE特点:检测片断范围为100-500bp。检出率高,无需放射标记。需特殊的制胶设备；需合成带GC夹的引物。应用:DNA中单个碱基替代、微小缺失或插入检测。突变筛查技术2单链构象多态性（SingleStrandConformationalPolymorphism，SSCP）原理：单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差异，该差异使相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同。与PCR技术联合应用，称为PCR-SSCP技术检测片断长度：最好小于300bp.

策略:在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物，进行PCR扩增。产物经甲酰胺等变性，在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置差异，从而作出判断。应用：DNA中单个碱基替代，微小缺失或插入检测。SSCP３.变性高效液相色谱(DenaturingHighPerformanceLiquidChromatography，DHPLC）：利用高效液相色谱原理，PCR扩增后的DNA片断经DNA分离柱分离，经流动相洗脱的核酸片段通过紫外或荧光检测器检测转换成数字信号储存于计算机中，进行分析。

DNA柱分离原理:DNA在：非变性条件下按照片断长度分离双链DNA,适合做片断大小分析;部分变性条件下可检测变异(突变或多态);完全变性条件下用于分离、纯化单链核酸片段DHPLC分析DNA变异的原理：工作温度(柱温)是决定DHPLC敏感性的最关键因素。在DNA部分变性条件下，变异型和野生型DNA可形成同源和异源双链．其在色谱柱上保留时间存在差异，异源双链因存在错配区而更易变性，在色谱柱保留时间短于同源双链而先被洗脱下来，从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线，据此可以分辨出变异型DNA.在经历95℃变性再缓慢复性后,存在多态或突变位点的靶序列PCR产物会杂交形成杂合双链(heteroduplex)和纯合双链(homoduplex)混合物

TEAA(三乙铵醋酸盐)DHPLC的特点：灵敏，准确；分析速度快，单个样本的分析时间仅需几分钟；容易实现自动化操作；适用于较大样本中基因突变的筛查检测变异的PCR产物长度范围最好在200～500bpDHPLC的应用：

DNA片断中突变的检测和筛查；

多态的研究和基因型分析如SNP；甲基化分析；基因表达分析；寡核苷酸的纯化与分析；

4等位基因特异性PCR（Amplificationrefractorymutationsystem,ARMS）--检测已知突变的一种方法。５蛋白质短截检测（Proteintruncationtest，PPT）应用:检测因移码突变、剪接位点突变或无义突变所致的蛋白质截短。６化学切割错配（Chemicalcleavagemismatch，CCM）

三、DNA测序

是指测定DNA克隆片段的精确核苷酸序列。最常用的方法是Sanger方法，即双脱氧链末端终止法。基本原理：

待测DNA为模板，应用DNA聚合酶，在合成DNA新链的过程中，分别掺入四种2′3′-双脱氧核苷酸(ddATP,ddGTP,ddCTP,dTTP)，掺入的ddNTP无法形成磷酸二酯键而终止DNA链的延伸；将产生不同长度的DNA片段，在变性凝胶电泳中呈梯状带型，可以直接读出DNA序列。Dideoxynucleotideblockschainelongationhttp://www.cbs.dtu.dk/staff/dave/roanoke/fig5_38.jpghttp://www.cbs.dtu.dk/staff/dave/roanoke/fig5_38.jpgDNA自动测序（第一代测序）第二代测序技术是对传统测序的革命性改变。一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，称为高通量测序技术。可对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析，又称深度测序(deepsequencing)。

Sanger测序法一次读取1、2条序列

毛细管测序法一次读取96条序列.

二代测序一次读取几百万条序列，是一次革命性变革。现有的二代测序技术平台主要包括454(GS-FLX),Solexa,SOLID,polonator

测序原理：合成法测序连接法测序第二代测序技术不仅保持高准确度，而且大大降低测序成本、极大提高测序速度。其测序结果长度较短，比较适合于对已知序列的基因组进行重新测序，在对全新的基因组进行测序时还需要结合第一代测序技术。第三代测序的技术平台之一，

纳米孔单分子技术提高读取长度，减少测序后的拼接工作量，实现对未知基因组进行测序。

将基因组DNA打碎成小片段，制成液滴分散于纳米孔，孔底部锚定DNA聚合酶。当荧光标记的dNTP与测序模板结合，荧光被激发和检测，然后DNA聚合酶将荧光标记切割、释放，DNA聚合酶转入下一位置四、转录调控分析基因转录调控是细胞对内、外刺激发生应答的方式，涉及到基因组DNA和一系列结合蛋白的相互作用。为深入研究基因转录调控的分子机制，须研究DNA与蛋白质相互作用，弄清楚特定基因转录调控区域与哪种/些转录因子发生了特异性结合。并需检测相关基因启动子的活性。1）DNA与蛋白质相互作用的研究，生物信息学：预测DNA上可与特定转录因子结合的保守序列。电泳泳动迁移检测(ElectrophoretjcMobilityShiftAssay，EMSA)染色质免疫沉淀（ChromatinImmuno-precipitation，ChIP)DNasel足纹（迹）法酵母单杂交等；2）报告基因检测分析

1电泳泳动迁移检测(EMSA)EMSA：ElectrophoresisMobilityShiftAssayDNA片段与蛋白质结合后，其在凝胶中的迁移率明显降低，据此可检测DNA和蛋白质的相互作用（invitro)。RegulatoryRegionCodingSequenceGeneRegulationbyTranscriptionFactorsTheProbeDoublestrandedoligonucleotides

containingatranscriptionfactorbindingsite5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’3’-TCAACTCCCCTCAAAGGGTCCG-5’Bindingmotif

主要步骤：

标记探针同核蛋白反应电泳放射自显影EMSA:PrincipleR.Voll09/01Adouble-strandedoligonucleotidecontainigaNF-B-bindingsiteislabeled

witharadioactiveisotopeandincubatedwithanuclearextract.Duringgel-electrophoresis,NF-Bboundtotheoligonucleotidecausesashiftcomparedtothefreeprobe.NF-BFreeProbeRadioaktivelylabeledoligonucleotidewithNF-B-bindingsite(probe)andboundNF-B

RadioactivelylabeledoligonucleotidewithNF-B-bindingsite(probe)EMSA超泳动supershift另外还需通过应用核心序列突变的探针、以及未标记探针与标记探针的竞争等实验进一步证明转录因子与探针的特异结合。2染色质免疫沉淀(ChromatinImmunoprecipitation，ChlP)基本原理:在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，细胞内存在的许多DNA与蛋白质间的相互作用被保留下来。细胞裂解后,用超声波或酶将染色质随机切断为一定长度范围的小片段，再经免疫学方法沉淀目的蛋白质与DNA的复合体，特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的DNA片断的纯化与检测，获得蛋白质与DNA相互作用的信息(invivo)。应用：ChIP不仅可以检测体内转录因子与DNA的结合，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。ChromatinImmuno-precipitation(ChIP)若ChIP技术与二代测序技术结合，称为ChIP-Sequencing，可以分析某种特异DNA结合蛋白在全基因组范围内的DNA结合位点、组蛋白修饰、核小体定位等。可应用到任何基因组序列已知的物种，可确切得到每一个片段的信息。是真核生物基因表达调控研究的常用方法报告基因(reportergene)是一种编码易被检测的蛋白质或酶的基因。将报告基因编码序列与待测基因的表达调控序列融合，在调控序列控制下进行表达，利用其表达产物来标定待测基因的表达调控。3.报告基因检测作为报告基因，应具备以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(