药物检验工-12高效液相色谱法

液相色谱法

液相色谱法：以液体为流动相的色谱法称～。1经典液相色谱：固定相颗粒较大且不均匀

常压下输送流动相柱效较低

分析周期长现代液相色谱：固定相颗粒小且均匀

高压下输送流动相柱效较高分析周期短经典液相色谱包括：

柱色谱和平面色谱高效液相色谱法HPLC第一节概述highperformanceliquidchromatography以气相色谱理论为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法HPLC与经典LC区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1．经典LC：仅做为一种分离手段

柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm且不均匀常压输送流动相柱效低（H↑，n↓）分析周期长无法在线检测，灵敏度差2．HPLC：分离和分析

柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱）高压输送流动相柱效高（H↓，n↑）分析时间大大缩短可以在线检测，灵敏度高二、HPLC与GC差别相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测主要差别：分析对象的差别和流动相的差别1．分析对象

GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、热稳定性差、离子型等样品不可检测占有机物的20%

HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80%2．流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用

HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性3．操作条件差别

GC：加温操作

HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）三、高效液相色谱仪流程图1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）2．高压泵（输液泵）3．进样装置4．色谱柱——分离5．检测器——分析6．废液出口或组分收集器7．记录装置固定相和流动相1、固定相：非极性键合相如十八烷基硅烷键合硅胶（C18，ODS柱——HPLC约80%问题）2、流动相：流动相极性>固定相极性底剂（水）+与水混溶的极性调节剂

常用甲醇－水、乙腈－水等3、分离机理：疏溶剂理论为代表(了解)溶质的保留机理是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合。不是溶质分子与键合相间的色散力流动相洗脱方式1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）——类似GC的等温度洗脱；以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）具有方法简便、重复性好、色谱柱易再生等优点。对于成分复杂的样品，往往不能兼顾某些性质相差很大组分的分离要求2）梯度洗脱：——类似GC的程序升温在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例，即不断改变其极性（两个泵）。适于分析极性差别较大的复杂组分

缩短分析周期；提高分离效果；改善峰形；增加检测灵敏度有时引起基线漂移、重复性较差2023/2/1峰的鉴别：1．苯；2．氯苯；3．对二氯苯4．1，2，3三氯苯；

5．1，3，5三氯苯；6．1，2，4三氯苯；

7．1，2，3，4四氯苯；8．1，2，4，5四氯苯；

9．五氯苯；10.六氯苯（a）梯度洗脱两种洗脱方式的比较（b）等度洗脱溶剂系统选择的一般原则RBPC流动相极性越强，洗脱能力越弱。（1）溶剂种类：水+甲醇、水+乙腈（2）溶剂比例：水的比例增加，使k增大（3）溶剂pH：影响弱酸、弱减的离解流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱碱k变小选择流动相时应注意的几个问题：（1）尽量使用高纯度试剂（色谱纯）作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相的pH介于2~8一、输液系统高压输液泵恒压泵：流量精度不稳恒流泵（常用）：在输送流动相过程中流量恒定。常用柱塞往复泵双泵：为了克服流量的脉动。有串联式和并联式高效液相色谱仪输液泵应具备的性能：流量精度高且稳定流量范围宽能在高压下连续工作液缸容积小密封性能好，耐腐蚀

高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。进样阀二、进样系统三、分离系统色谱柱（column）由柱管（不锈钢管）和固定相组成分析柱（直径4~6mm如4.6mm，柱长10~30cm）、制备柱柱效评价：色谱系统适应性试验R≥1.5，n（符合规定），fs（0.95~1.05）柱再生：维护、保养、柱子的冲洗（了解）

保护柱

一般在分析柱前装上较短的保护柱，不仅可除去溶剂中的颗粒杂质和污染物，而且可除去样品中含有与固定相不可逆结合的组分，以保护较昂贵的分析柱，延长使用寿命。

柱恒温器

对色谱柱严格控制温度可获得重现性更高保留值和更好分离色谱图。四、检测器

1、紫外检测器：适于吸收紫外光的物质

检测原理：朗伯－比尔(Lambert-Beer)定律，响应信号（吸光度）与浓度成正比A=εCl特点：灵敏度较高（10-6—10-9g/ml），噪音低，线性范围宽，稳定性好，适于梯度，不破坏样品，应用广（分析、制备）。局限：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长。专属型、浓度型检测器续前紫外检测器类型：1）固定波长检测器：254nm2）可变波长检测器：光源：氘灯（和钨灯），200—400（800）nm，单色器，流通池（试样），光电管光路系统和紫外分光光度计相似3）光电二极管阵列检测器(DAD)：在获得色谱图的同时，还可以获得个组分的光谱图。即获得三维光谱－色谱图。用途：吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用于定量,判断峰纯度2.红外吸收检测器与一般光吸收检测器光路设计相似，其吸收池窗口采用氯化钠、氟化钙等红外透明材料，透过吸收池的红外光一般以热电敏感元件接收。这种检测器可提供分子结构信息，但由于大多数液相色谱流动相溶剂都有红外吸收及窗口材料限制，其应用有限。

高灵敏度、高选择性对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应.3.荧光检测器(FluorescenceDetector，FD)除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；

通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种；4.示差折光检测器（DifferentialRefrativeIndexDetector,RI）5.蒸发光散射检测器(EvaporationLightScatteringDetector,ELSD)ELSD的响应不依赖与样品的光学特性，可以检测没有紫外吸收的有机物质，如人参皂苷、黄芪甲苷等。任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，不受其官能团的影响。（1）用惰性气体雾化脱洗液（2）流动相在加热管（漂移管）中蒸发（3）样品颗粒散射光后得到检测。6.电化学检测器

基于电化学原理和物质的电化学性质进行检测，主要有安培、极谱及电导等几种类型，适用于测定具有电化学氧化还原性质及电导的化合物，如含硝基、氨基等有机化合物及无机阴、阳离子等。1.氟塑料池体,2.工作电极,3.氟塑料或聚酯垫片,4.接参比电极，至废液，5.接色谱柱。流动相

泵色谱柱检测器

泵输液分离检测

记录AEGBCDF进样阀进样1、排气2、进样阀3、跑基线4、开始进样，并进行测试5、测试完毕，清洗进样阀和整个HPLC仪器6、流量调小，先关排液阀，再关泵7、先关计算机，再关液相色谱HPLC基本流程图定性分析和定量分析主要影响因素：时间强度数据分析及影响因素流动相和色谱柱2023/2/1第八节定性、定量分析方法（同GC法）一、定性分析方法

1.色谱鉴定法——保留时间

2.化学鉴定法

3.色谱-光谱联用鉴定法（1）非在线色谱光谱联用法（2）色谱-光谱联用仪2023/2/1二、定量分析方法——同GC（自己看）

1.外标法：应用较为广泛

2.内标法：内标法分为工作曲线法、内标对比法等。

内标对比法：不需知校正因子，又具有内标法的定量准确度与进样量无关的特点，方法简便实用。在药物分析中分析结果（含量）常用标示量％表示：§6-2定量方法1.定量依据m＝fi·Aifi定量校正因子Ai色谱峰峰面积（信号）m1+m2+m3+…+mi+…mn（1）归一化法试样中的成分都能出峰则有：Wi=mim=mi×100%2.测量方法：f1A1+f2A2+…+fiAi+…fnAnWi=mim=fiAi×100%即若f差别不大，则有A1+A2+…+Ai+…AnWi=Ai×100%也可以用峰高代替峰面积进行计算

fx

Axmsmx

fsAs所以ms

fsAsmxfxAx已知内标标准样品的浓度为cs，设未知样品的浓度为cx，上机测定得到的峰面积分别为As

，Ax

标准物质ms=fsAs未知物质mx=fxAx==（不同物质f不同）用标准物质测出fx和fs,然后求得cx（2）内标法01二月202333内标物的选择内标物峰与试样中所有成分的峰完全分离。内标物峰与目标成分峰保留时间不应差太远。内标物具有与分析目标成分类似的化学性质。

理化性质与待测物相近色谱响应与待测物相近与待测物有良好的分离，但不能相距太远与待测物的峰面积比为0.7-1.3最好，因此要根据待测物的浓度确定内标物的添加量例