第11章 DNA文库的构建和目标基因的筛选

上章要点回顾1、Maxam-Gilbert化学降解法2、Sanger双脱氧链终止法第十一章

DNA文库的构建和目标基因的筛选基因文库(genelibrary)：指某一生物分离的全部基因的集合。基因组DNA文库：

指将是指某个生物的基因组DNA与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，通过筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。cDNA文库：指某生物某一发育时期、某一组织或某种环境条件下所转录的mRNA经逆转录形成的cDNA片段与载体连接转化受体细胞而形成的克隆的集合。噬菌斑菌落主要内容第一节基因组DNA文库的构建第二节cDNA基因文库的构建第三节基因克隆的筛选策略第四节DNA文库的保存

8第一节基因组DNA文库的构建一、基因组DNA文库的类型1、质粒文库：容纳片段小于10kb，以菌落的形式保存和筛选，一般用于对大片段文库的亚克隆，用于鸟枪法测序等。2、噬菌体文库：一般用λ噬菌体载体，插入型容纳片段小于7kb，适合于构建cDNA文库，置换型容纳9-25kb，适合于构建亚克隆文库或直接构建基因组文库。95、亚基因组文库：文库的对象只是基因组的一部分，可用染色体显微切割、特定YAC富集等方法而产生，用于针对特定目标基因对大片段文库的深入研究。4、人工染色体文库：BAC、YAC、PAC等文库，最大插入片段分别为300kb、1000kb和150kb，是大片段文库，主要用于基因组测序和图谱构建。6、基因组文库的发展：略3、粘粒文库：一般用于直接构建基因组文库，最长插入片段比λ噬菌体文库略长，达45kb左右。10二、文库的代表性和随机性为保证能从基因组文库中筛选到某个特定的基因，基因组文库必须有一定的代表性和随机机。11代表性：指文库中所有克隆所携带的DNA片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段DNA。

代表性意味着文库要有完备性，是指在构建的基因文库中任一基因存在的概率。它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：

N=ln(1–P)/ln(1–f)。P

：任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率f

：克隆片段的平均大小/生物基因组的大小。例：假如重组片段大小为20kb，要使文库包含该基因组任一片段的概率达到99%，则N(E.coli)=ln(1-0.99)/ln(1-20/4600)=1057N(人)=ln(1-0.99)/ln(1-20/(3×109))=6.9×105随机性：

既表示构建文库时要从基因组DNA获得随机断裂的片段，也表示构建好的文库中所有基因要有相等的筛选概率。基因文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：

1、重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力；

2、载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆；

3、克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利于克隆排序和染色全步查；

4、克隆片段易于从载体分子上完整卸下进行亚克隆；

5、重组克隆能稳定保存、扩增和筛选，文库繁殖后失真度小。

1．基因组DNA文库的载体制备载体的好坏是影响连接成功与否的关键，载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。三、基因组DNA文库的构建流程

2．高质量大相对分子量基因组DNA的提取和部分酶切构建不同大小插入片段的基因组文库对DNA相对分子质量要求不同，一般所提取的DNA分子量至少应该是文库最终平均插入片段长度的3～5倍。

3．外源DNA的连接转化或包装侵染

一般在构建大片段基因组DNA文库时，大量连接前都要先使用小体系连接来寻找最适的比例。在电转化和包装侵染过程中，首先最好选择转化效率高的感受态细胞和最佳的转化条件或效价高且质量稳定的包装蛋白。5、文库的质量检测克隆子数目要足够多，覆盖度要足够高(4-6倍或更高)。覆盖倍数=平均插入片段长度×

克隆数/基因组DNA的长度。

或：覆盖倍数=所有探针筛选到的阳性克隆子数/总探针数。

另外，植物基因组文库中叶绿体DNA的比例：小于5%。第二节cDNA基因文库的构建一、cDNA文库的特征1、基因特异性：1）cDNA只含有对应于成熟mRNA的转录区，不含启动子、终止子、内含子、基因间隔区等。2）cDNA一般较短，平均长度1.5kb左右，多数为100bp至10kb。2、器官特异性3、代谢或发育特异性4、表达量不均匀性二、cDNA文库的构建步骤：

1、细胞总RNA的提取和mRNA分离；2、第一链cDNA合成；3、第二链cDNA合成；3、双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。cDNA文库构建流程图1、RNA的分离

mRNA是构建cDNA文库的起始材料。由于mRNA在总RNA中所占比例很小，因此从总RNA中富集mRNA是构建cDNA文库的一个重要步骤。通过降低rRNA和tRNA含量，可大大提高筛选到目的基因的可能性。利用Poly(A)尾巴纯化或直接提取mRNA。2、第一链cDNA的合成由mRNA到cDNA的过程称为反转录，由反转录酶催化。反转录酶：

AMV和Mo-MLV。合成DNA是需要引物引导：

oligo(dT)引物；随机引物。2、第一链cDNA的合成

由mRNA到cDNA的过程称为反转录，由反转录酶催化。反转录酶：

AMV和Mo-MLV。合成DNA是需要引物引导：

oligo(dT)引物；随机引物。3、第二链cDNA的合成

cDNA第二链的合成就是将上一步形成的mRNA-cDNA杂交双链变成互补双链cDNA的过程。自身引导合成法：置换合成法：引导合成法：引物-衔接头合成法：

第一链合成后直接采用末端转移酶（TdT）在第一链cDNA

的3’-端加上一段Poly（dC）的尾巴，然后用一段带接头序列的Poly（dG）短核苷酸链作引物合成互补的cDNA

链。244、双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖由于平端连接效率低，双链cDNA

在和载体连接之前，要经过一系列处理，如同聚物加尾、加接头和分级分离。总cDNA的分级分离：采用排阻层析柱，去除过大和过小的cDNA分子，保留500bp至8kb的总cDNA，以提高连接后文库的质量。25三、cDNA文库的均一化处理1、基因组DNA饱和杂交法mRNA水平上，基因之间丰度差异极大。基因组水平，基因之间拷贝数差异不大。将随机打断的基因组总DNA片段标记为探针，与总cDNA单链饱和杂交，弃除未杂交的总cDNA，从cDNA-DNA杂交体上变性释放除均一化后的总cDNA，转化宿主。2、基于复性动力学(second-orderkinetics)原理的均一化处理浓度大的DNA复性所需时间短，浓度越小复性越迟。控制复性时间，使高丰度cDNA呈双链状态，低丰度cDNA呈单链状态，利用羟基磷灰石柱将单链和双链cDNA分开，保留单链cDNA后转化宿主。26四、扣除杂交cDNA文库利用分子杂交原理，去除非差异表达基因的cDNA，保留差异表达的基因的cDNA用于制备文库。tester:待测样本的总cDNA。driver:表达谱背景一致但不含目的基因的总cDNA。tester与过量的driver杂交，去除二者共同表达的cDNA，保留差异表达基因。SSH原理2、mRNA-cDNA杂交：过量的驱动总mRNA（末端生物素标记）与总cDNA杂交，利用生物素磁珠法将公共表达基因去除。29五、全长cDNA文库

cDNA不完整的原因：mRNA的降解、第二链合成中DNA聚合酶的外切核酶活性、反转录酶与mRNA模板的脱离(主要受mRNA复杂结构影响)。1、SMART全长cDNA文库的构建方法为Clontech公司的专利试剂盒原理，应用广泛，其独特的反转录酶具有末端转移酶活性，RTase自动在反转录得到的全长cDNA第一链的3’末端加上oligo(dC)，利用具oligo(dG)的接头引导第二链的合成。由于oligo(dC)比较短，因此较短的oligo(dG)容易介导合成假全长cDNA。SMART技术构建全长cDNA文库的原理312、Cap-Trapper法构建全长cDNA文库在mRNA的两端均打上生物素标记，合成cDNA第一链时用dm5CTP代替dCTP，用RNaseⅠ消化单链RNA。3、TAP法构建全长cDNA文库

Invitrogen公司的试剂盒原理，首先利用碱性磷酸酶处理使非全长mRNA无效化。用烟草酸焦磷酸酶处理以移去全长mRNA的帽子结构，然后为脱帽后的全长mRNA的5’末端接上人工接头，利用具oligo(dT)的人工接头进行反转录，得到的全长cDNA第一链的两端就打上了特别设计的人工接头，可用PCR法对全长总cDNA进行放大，酶切后与载体连接。33六、其它cDNA文库表达cDNA文库：

用表达载体构建全长cDNA文库，文库的每一个克隆子可以表达出蛋白，利用蛋白对克隆子进行筛选。双杂交全长cDNA文库：

将表达文库与酵母双杂交系统结合使用，利用酵母作宿主，通过融合蛋白的酵母双杂交对克隆子进行筛选，用于鉴定可与特定蛋白相互作用的基因，主要为转录因子。重组酶克隆策略的cDNA文库：

将重组酶的特异识别序列attP1和attP2构建到每个cDNA的两端，在非消化情况下实现与载体的重组连接，避免了基因被切断。34第三节基因克隆的筛选策略

大型基因组文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成，从其中筛选分离出某一个特定基因并不是件简单的事。一、表型筛选法一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白编码基因等）可以赋予宿主特定的表型，可以采用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法等）直接筛选，宿主多为突变体。35二、杂交筛选和PCR筛选

1、杂交筛选362、PCR筛选法：将文库贮存于多个96或384孔板中，首先通过PCR确定目标基因所在的特定PCR板(主混合池筛选)，然后通过PCR确定目标基因在特定PCR板上的特定行和列(行混合池筛选和列混合池筛选)，最后通过逐个克隆的PCR确定目标基因所对应的克隆子。37三、免疫筛选首先制备和纯化得到目标基因的抗体，然后利用抗体来筛选目标基因所在的表达文库，得到目标基因所对应的克隆子。方法有原位检测和免疫沉淀检测。1、原位检测法滤膜（固定抗体）+2、免疫沉淀检测法菌落沉淀