核磁共振内标法定量分析肝素钠中多硫酸软骨素

核磁共振内标法定量分析肝素钠中多硫酸软骨素高照明;张玉冰;于永良@@1rn,L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖D证明,肝素钠还具有抗炎、抗过敏、抗病毒,抗癌等多种生物学功能.200881FDAOSCSOSCSquantitativeanalysisofOversulfatedChondroitinSulfateby1H-NMRinternalstandardmethodhasbeendevelopedinthispaper.Theoptimumexperimentalconditionshavebeendescribed.Thelinearrangeofthemethodwasfoundtobe0.1％-5％.Theregressionequationderivedwasy＝2.7929x-0.0317(r＝0.9994).Thelimitofdetectionwas0.1％.Theaveragerecoveryratewasshowntobe98.1％(n＝6),andtheRSDwas0.35％(n＝6).Theresultsshowedthat1H-NMRcanbeusedforthequantitativedeterminationofcontaminantsinheparin.【期刊名称】《分析化学》【年(卷),期】2011(039)004【总页数】2页(P601-602)【作者】高照明;张玉冰;于永良【作者单位】生态化工教育部重点实验室,青岛科技大学化工学院,青岛,266042;生态化工教育部重点实验室,青岛科技大学化工学院,青岛,266042;生态化工教育部重点实验室,青岛科技大学化工学院,青岛,266042【正文语种】中文肝素钠是一种由葡萄糖胺,L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成的黏多糖硫酸脂钠盐,是临床大量应用的抗凝血药。研究证明,肝素钠还具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等多种生物学功能。2008年初,欧美各国发生了肝素钠注射液事件,致使81人死亡。随后,美国FDA应用核磁共振方法在肝素钠原料药中定性查出杂质多硫酸软骨素(OSCS),并认为OSCS是引起用药异常的杂质。肝素与OSCSOSCS;国内将多糖全水解,然后衍生,采用液相色谱法分析[5]。但上述方法都具有局限:液相色谱法样品前处理复杂,水解时间长(4h),且肝素OSCS1h);而核磁共振氢谱方法大多用于常量定性分析。随着核磁共振仪器分辨率的提高、价格的降低和单次测试成本降低,核磁共振氢谱定量分析在工业大样本测试中得到发展,但灵敏度与色谱相比仍有差距,特别是对高聚物、多糖OSCS仪器与试剂Avance500Bruker5mmBBO探头;AL2040.1mg;HP3DCEAgilent(50μm×56cm,BeckmanMillipore:CAT.NO.1304038USPROCKVILLE.MDLOTFOH210,OSCS标准品:CAT.NO.1133580USPROCKVILLE.MDLOTFOI113FDA);D2O(99.8%DCILropionic,TSP,98%DSigma);H3PO4(广州化学试剂厂)。NMR(CENMR1H:500.03MHz,脉冲序列(Pulprog)Zgcppr,数据点(TD):65536,采样次数(NS):100,谱宽(SWH):9615.385Hz,FID(Fidres):0.146719Hz,采样时间(AQ):3.407940s,接收增益(RG):90.5,温度(TE):298K,驰豫时间(D1):4.00s,窗函数(LB):1.00Hz。CE36mmol/LpH3.5)200nm25℃,25kVkPa3s。(1)TSPTSP10mg50mLTSP(2)肝素钠标准溶液的配制准确OSCS25mg5mm0.6mLTSP5min,静置,待溶液澄清均匀即可进行实验。(3)OSCS12.5mgOSCS6mLTSP(4)OSCS25mg5mm0.6mLOSCSOSCS25mg0.3mLOSCS0.3mLTSP2.5%(w/w)OSCS1%,0.5%,0.2%,0.10.05%(w/w)OSCS2.425mg5mm0.6mLTSPNMR素钠精品2mg,加水制成约2g/L溶液,即可进行CE实验分析。标准品NMROSCS含量测定方法的建立及氘代溶剂及内标物的选择肝素钠、OSCS为溶剂。本研究的内标物既作为计算样品含量而设的标定物,又是化学位移数值的TSPTSP(δ)0,在OSCSOSCSδ2.04N-乙酰胺基的甲基的信号;OSCS在δ2.15处有独立单峰OSCSN-乙酰胺基的甲基的信号;此峰是较尖锐的单峰,可分别定义为两者OSCS112.3处的TSP40.00OSCSδ2.15y=2.7929x-0.0317,r=0.9994。表明OSCSδ2.04/1099.96,RSD1.31%。表明OSCSOSCS0.10%～5.00%时,核磁共振氢谱均能检出肝素钠OSCSOSCS0.05LOD0.1%。1.0%OSCS24hδ2.15δ2.040.0273,RSD0.7424h取含1.0%(w/w)OSCS的肝素钠溶液,在同一实验条件下连续进行6次平行NMR测试,并以δ2.04与δ2.15相对积分面积的比值考察实验的重复性,RSD为0.35%(n=6)。实验的重复性较好。5%(w/w)OSCS20mg65mmOSCS0.6,0.6,0.4,0.4,0.20.2mL,再向每支核磁TSP0,0,0.2,0.2,0.40.4mL,进行回收率实验,平均回收率98.1%,RSD0.95%。3.4样品测定和分析分别取6个不同厂家的肝素钠工业精品,按照上述实验条件和测试方法进行测试,每个样品的积分值测定3次,取平均值。为便于比较,样品同时进行了毛细管电泳(CE)检测,检测方法按2.2和2.4项进行,结果表明,核磁共振方法和毛细管电泳方法检测结果相符。在测试样品量充足的情况下,在OSCS含量为0.2%～0.5%时,核磁共振方法仍具有较好的检出能力。【相关文献】U.S.FoodandDrugAdministration,CenterforDrugEvaluationandResearchSiteonAdverseeventsAssociatedwithHeparin,/cder/drug/infopage/heparin/default.htm,2008WANGHao,YUGuang-Li,ZHAOXia,HAOCui,HUYan-Nan,YINXiu-Hong().ChineseJ.Anal.Chem.(分析化学),2009,37(8):1147～1151McEwenI,MulloyB,HellwigE.PharmeuropaBio.,2008Dec,2008(1):314LiuHY,ZhangZQ,LinhardtRJ.NaturalProductReports,2009,26,(3):313～3215