四川理工学院酶1

第五章酶与生物催化剂酶的化学本质：蛋白质酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物具有高效催化作用的蛋白质。目前将生物催化剂分为两类：酶、非酶生物催化剂（核酶，脱氧核酶等）1概述：酶的研究历史酶的发现和提出：1897年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母汁成功实现了发酵。提出了发酵与活细胞无关，而与细胞液中的酶有关。1913年，Michaelis和Menten提出了酶促动力学原理—米氏学说。1926年，Sumner从刀豆种子中分离、纯化得到了(Urease)脲酶结晶，首次证明酶是具有催化活性的蛋白质。1978年，Cech对四膜虫的研究中发现RNA具有催化作用。1995年，JackW.Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性DNA片段，称为脱氧核酶(deoxyribozyme)。2

5.1酶的概念及作用特点生物催化剂（Biocatalysts）：活细胞产生的具有催化功能的生物大分子（包括酶和核酶）。酶(Enzyme）：是活细胞产生的一类具有催化功能的蛋白质。其化学本质是蛋白质。核酶（Ribozyme）：具有催化功能的核酸分子。其化学本质是核酸。酶催化的生物化学反应，称为酶促反应(Enzymaticreaction)。在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物(Substrate)。5.1.1酶（Enzyme）的概念3

5.1.2酶的作用特点（一）酶和一般催化剂的共性①用量少而催化效率高；②它能够改变化学反应的速度，但是不能改变化学反应平衡。酶本身在反应前后也不发生变化。③酶能够稳定底物形成的过渡状态，降低反应的活化能(Ea)，从而加速反应的进行。4

1．高效性（酶具有极高的催化效率）

酶的催化作用可使反应速度提高10７–101３倍。例如：过氧化氢(Catalase)分解2H2O2

2H2O+O2

用Fe3+

催化，效率为6×10-4mol/S用Catalase催化，效率为6×106mol/S转换数（Turnovernumber）的概念：每秒钟每个酶分子能催化底物发生变化的微摩尔数，用kcat表示（mol/S）。-淀粉酶催化淀粉水解，1克结晶酶在65C条件下可催化2吨淀粉水解。（二）酶作为生物催化剂的特性5酶的催化效率通常比非催化反应高108～1020倍，比一般催化剂高107～1013倍。酶加速反应的机理是降低反应的活化能(activationenergy)。活化分子所具有的高出平均水平的能量称为活化能6反应总能量改变非催化反应活化能酶促反应活化能一般催化剂催化反应的活化能能量反应过程底物产物酶促反应活化能的改变活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。7过氧化氢分解反应所需活化能

催化剂每摩尔需活化能无18000cal胶态钯11700cal过氧化氢酶2000cal82．具有高度专一性(HighSpecificity),又称为特异性指酶在催化生化反应时对底物的选择性，即一种酶只能作用于某一类或某一种特定的物质。亦即酶只能催化某一类或某一种化学反应。

绝对特异性(absolutespecificity)相对特异性(relativespecificity)立体结构特异性(stereo

specificity)9绝对特异性酶只作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物

。如：10相对特异性酶作用于一类化合物或一种化学键。如：11立体结构特异性酶仅作用于立体异构体中的一种。乳酸脱氢酶只作用于L-乳酸，而对D-乳酸没有作用123．反应条件温和酶促反应一般在pH5-8水溶液中进行，反应温度范围为20-40C。高温或其它苛刻的物理或化学条件，将引起酶的失活４．酶易失活凡能使蛋白质变性的因素如强酸、强碱、高温等条件都能使酶破坏而完全失去活性。所以酶作用一般都要求比较温和的条件如常温、常压和接近中性的酸硷度。13５.酶活力可调节控制如抑制剂调节、共价修饰调节、反馈调节、酶原激活及激素控制等。

６.某些酶催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关。如乙醇脱氢酶(NAD为辅酶)

NAD：尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸14

酶作为生物催化剂的特性1．高效性2．专一性3．反应条件温和４．酶易失活５.酶活力可调节控制６.某些酶催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关。小结155.2酶的命名及分类(1)习惯命名法:根据酶催化底物来命名（Proteinase,Amylase）根据所催化反应的性质来命名（水解酶；转氨酶；裂解酶等）结合上述两个原则来命名（琥珀酸脱氢酶）有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点（Pepsin、Trypsin、硷性磷酸脂酶和酸性磷酸脂酶）。优点：简单易记缺点：不能充分反映酶作用特点5.2.1酶的命名16(2)国际系统命名法

（国际酶学委员会１９６１年提出）系统名称包括底物名称、构型、反应性质，最后加一个酶字。例如：习惯名称:谷丙转氨酶（GPT)系统名称:Ala：-酮戊二酸氨基转移酶酶催化的反应:-ketoglutarate+Ala

Glu+Pryvate

GPT丙酮酸-酮戊二酸175.2.2酶的分类（一）国际系统分类法记住6大类的编号:氧转水裂异合18

例如：LDH(乳酸脱氢酶)的编号是：

LDHLacticacid＋NAD+Pyruvate＋NADH219氧化-还原酶催化氧化-还原反应。主要包括脱氢酶(Dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，LDH催化乳酸的脱氢反应。1.氧化-还原酶类Oxido-reductases20转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。

例如，谷丙转氨酶(GPT)催化的氨基转移反应。2.转移(移换)酶类Transferases21水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括Amylase、Proteinase、Nuclease及Lipase等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：3.水解酶类

Hydrolases22主要包括醛缩酶、水化酶（脱水酶）及脱氨酶等。裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子而形成双键的反应及其逆反应。例如，苹果酸裂合酶即延胡索酸水合酶(Fumarase)催化的反应。4.裂合（裂解）酶类Lyases延胡索酸苹果酸23异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。

例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。5.异构酶类Isomerases6-磷酸葡萄糖6-磷酸果糖24合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的形成反应。这类反应必须与ATP（或其他高能化合物）分解反应相互偶联。A+B+ATP+H-O-H===A－B+ADP+Pi

例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。

Pryvate+CO2oxoloacetate

草酰乙酸(OAA)6.合成酶类LigasesorSynthetases丙酮酸25结合酶(conjugatedenzyme)单纯酶

(simpleenzyme)仅由氨基酸构成的酶。酶蛋白(apoenzyme)辅助因子(cofactor)全酶(holoenzyme)决定反应的特异性决定反应的种类与性质（二）按酶的化学组成分类26金属酶(metalloenzyme)金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失。

金属激活酶(metal-activatedenzyme)金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合不甚紧密。辅助因子(cofactor)金属离子小分子有机化合物27金属离子的作用参与催化反应，传递电子；在酶与底物间起桥梁作用；稳定酶的构象；中和阴离子，降低反应中的静电斥力等。小分子有机化合物的作用参与酶的催化过程，在反应中传递电子、质子或一些基团。28辅助因子按其与酶蛋白结合的紧密程度分为

辅酶(coenzyme):与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。

辅基(prostheticgroup):与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去。29单体酶(Monomericenzyme)：一般由一条肽链组成，如Lysozyme、Trypsin、Papain(木瓜蛋白酶)等。但有的单体酶有多条肽链组成，如胰凝乳蛋白酶由3条肽链，链间由二硫键相连构成一个共价整体。寡聚酶(Oligomericenzyme)：由2个或2个以上亚基组成，亚基间可以相同也可不同。亚基间以次级键缔合。如3-磷酸甘油醛脱氢酶、LDH等。多酶体系(Multienzymesystem)：由几种酶靠非共价键彼此嵌合而成。主要指结构化的多酶复合体如丙酮酸脱氢酶系、脂肪酸合成酶复合体等。多功能酶（Multifunctionalenzyme）:一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合，形成由多肽链组成并具有多种不同催化功能的酶，称为多功能酶或串珠酶。

（三）根据酶的分子结构特点分类30酶的聚集方式酶11.松散排列酶在细胞中各自以可溶的单体形式存在，彼此没有结构上的联系。反应时酶是随机扩散，催化效率不高。（如糖酵解历程）酶2酶3酶4酶531酶的聚集方式2.簇式排列

几种酶有机地聚集在一起，精巧的镶嵌成一定的结构，定向转移，形成多酶复合体。催化效率高。（如丙酮酸脱氢酶复合体、脂肪酸合成酶复合体）酶2酶3酶1酶4酶6酶532酶的聚集方式3.与生物膜结合一种结构更高的多酶复合体，酶整齐的排列在生物膜上。催化效率最高。（如呼吸链）酶1酶2酶4酶5酶333（四）、酶的活性中心必需基团(essentialgroup)酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的基团。酶的活性中心(activecenter)或称活性部位(activesite)，指必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。34活性中心内的必需基团结合基团(bindinggroup)与底物相结合催化基团(catalyticgroup)催化底物转变成产物维持酶活性中心应有的空间构象所必需。活性中心外的必需基团构成酶活性中心的常见基团：

His的咪唑基、Ser的－OH、Cys的－SH、Glu的γ-COOH。35底物活性中心以外的必需基团结合基团催化基团活性中心3663375.3

酶促反应的动力学

1.

酶活力（enzymeactivity）：也称酶活性，指酶催化一定化学反应的能力。其大小可用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的反应速度（reactionrate）来表示。

2.

酶反应速度：用单位时间内、单位体积中S的减少量或P增加量或一定量的S转化为P所需要的时间来表示。单位：浓度/单位时间一、酶活力与酶反应速度SPE通常测定P的增加量来表示酶反应速度38

引起酶反应速度降低的原因：底物浓度的降低；酶的部分失活；产物对酶的抑制；产物增加引起的逆反应速度的增加等。所以，研究酶反应速度以酶促反应的初速度（Initialspeed）为准，测定酶促反应速度必须在初速度时间内测定。初速度概念:

指反应刚刚开始的速度或底物消耗<5%的速度酶促反应速度曲线393、酶的活力单位

(1).酶的活力单位（U,Activityunit）：1961年，提出用“国际单位”（IU）表示酶活力，即：1个酶活力单位，是指在特定条件下，1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或转化底物中1微摩尔有关基团的酶量。(25C,最适底物浓度和最适pH）1IU=mol/min1972年，提出新的酶活力国际单位：最适条件下，每秒钟能催化1mol底物转化为产物所需的酶量，定为1Kat=1mol/s所以：1Kat=6×107IU

(2).酶的比活力(Specificactivity,S.A)：每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位数，用U/mg蛋白、IU/mg蛋白、Kat/mg蛋白表示。实质表示单位蛋白质的催化能力。40（1）分光光度法（Spectrophotometry）：多利用产物在紫外或可见光部分的光吸收性质，选择适当波长，测定反应过程的进行情况。简便、节约时间和样品，可以检测nmol/L水平的变化。苹果酸+NAD+

草酰乙酸+NADH2(NAD+在340nm无吸收)（NADH2在340nm有吸收）

SucroseFru+Glc产物

4、酶活力测定方法苹果酸脱氢酶Sucrase3,5-二硝基水杨酸Redcolor4142（2）荧光法(Fluorometry)：主要利用底物或产物的荧光性质。灵敏度高，但易受到干扰。（3）同位素测定法：同位素标记底物，反应后经分离，检测产物的脉冲数，即可换算成酶的活力单位。灵敏度最高。（4）电化学方法：pH计、氧电极法

甘油酯FA+GlycerolLipase1.加OH＋维持pH恒定，消耗OH＋的量代表酶活性的大小2.测定pH的降低程度，表示酶活性的大小3.其他方法43二、酶促反应的机理（一）酶-底物复合物的形成与诱导契合假说*诱导契合假说(induced-fithypothesis)酶底物复合物E+SE+PES酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。44锁－钥学说45诱导契合假说46（二）酶促反应的机制1.邻近效应与定向排列2.多元催化3.表面效应(surfaceeffect)47

多元催化

酶活性中心催化基团通过多种途径催化产物的生成

1．质子转移反应都包含广义酸-碱催化反应

2．酶可与底物形成瞬时共价键(共价催化)

3．酶可通过亲核催化或亲电子催化加速反应

48在疏水环境中进行酶反应有很大的优越性，此现象称为表面效应（surfaceeffect）。

酶的活性中心多位于其分子内部的疏水“口袋”中，酶反应在酶分子内部的疏水环境中进行。疏水环境可使底物分子脱溶剂化（desolvation）。排除水分子的干扰，防止酶和底物分子之间形成水化膜。

表面效应49酶促反应动力学研究酶促反应速度及其各种因素对酶促反应速度的影响。影响因素包括有酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。三、酶促反应动力学50几个概念酶促反应速度：用单位时间内底物的消耗量或产物的生成量表示研究酶促反应动力学要采用初速度初速度：反应速度与时间呈正比的阶段。反应10min.或底物消耗在5%51单底物、单产物反应酶促反应速度用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在5﹪以内）时的反应速度研究前提52（一）、底物浓度对反应速度的影响53当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。[S]VVmax54随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。[S]VVmax55当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应[S]VVmax5657※1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程式，简称米氏方程式(Michaelisequation)。ＶVmax[S]

Km+[S]＝当[S]＜＜Km时，v∝[S]；当[S]＜＜Km时，v≈Vmax5820世纪初观察到酶被底物所饱和的现象。当[E]、T、pH恒定时，在[S]很低的范围内，反应初速度(v)与[S]成正比：

v=k[S]当底物浓度达一定限度时，

V=Vmax米氏方程式(Michaelis-mentenequation)59三个假设底物的浓度显著的超过酶的浓度测定的速度为初速度在测定初速度的过程中中间络合物ES的浓度维持恒定。即达到平衡态。6061（稳态）6263（米氏常数）64656667E=EnzymeS=SubstrateP=ProductES=Enzyme-Substratecomplexk1rateconstantfortheforwardreactionk-1=rateconstantforthebreakdownoftheEStosubstratek2=rateconstantfortheformationoftheproducts68当[S]Km时，v=Vmax[S]/Km当[S]Km时,v=Vmax当[S]=Km时,v=Vmax/26970Km单位为mol/L71727.Km与Ks(特例)

Km不等于Ks(ES的解离常数,底物常数）。在K2<<K-1时，Km看作Ks，也只有此时1/Km才可以近似表示酶与底物结合的难易程度。8.Km与Km

无抑制剂时，ES的分解速度与形成速度的比值符合米氏方程，为Km;而有抑制剂时发生变化，则不符合米氏方程，为Km(表观Km)。

K-1+K2K-1Km=当K2<<K-1时，Km=

Ks=

K1K1S+EESE+PK1K－1K273

米氏方程的应用A、可以根据所要求的速度，求出应加入底物的合理浓度，或根据底物浓度求反应速度，如：例1.欲使V=99%Vmax,其底物的浓度应为：欲使V=90%Vmax,其底物的浓度应为：74例2.过氧化氢酶的Km为25mmol，底物的浓度为100mmol，求反应速度v。v=Vmax80%75[S]v1000km0.999V100km0.99V10km0.91V3km0.75V1km0.50V0.33km0.25V0.10km0.091V76B、鉴定酶:通过测定Km,可鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段、不同生理状态下催化相同反应的酶是否属于同一种酶。C、判断酶的最适底物：一种酶如果可以作用于几个底物，就有几个Km值。测定各种底物的Km值，可以找出酶的最适底物，Km值最小的是最适底物。77丙酮酸乳酸乙酰CoA乙醛乳酸脱氢酶（1.7×10-5）丙酮酸脱氢酶（1.3×10-3）丙酮酸脱羧酶（1.0×10-3）当丙酮酸浓度较低时，代谢走哪条途径决定于km最小的酶。

km

可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径。78（二）、酶浓度对反应速度的影响当[S]＞＞[E]，反应速度与酶浓度成正比。0V[E]关系式为：V=K3[E]79双重影响（三）、温度对反应速度的影响最适温度(optimumtemperature)：酶促反应速度最快时的环境温度。体内大多数酶的最适温度在35~40℃之间。最适温度不是酶的特征性常数。低温不使酶破坏。酶活性0.51.02.01.50102030405060温度ºC80pH影响酶与底物的亲和力。最适pH(optimumpH)：酶催化活性最大时的环境pH。体内多数酶的最适pH

接近中性，少数例外。最适pH不是酶的特征性常数测定酶活性时，应选用适宜的缓冲液，以保持酶的活性。（四）pH对反应速度的影响81最适pH(optimumpH)：酶催化活性最大时的环境pH。0酶活性pH胃蛋白酶淀粉酶胆碱酯酶24681082

抑制作用:凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称做酶的抑制剂（inhibitor，I）。很多药物、毒物、抗代谢物等都是酶的抑制剂。

失活作用:使酶蛋白变性失活（酶的钝化）的因素称变性剂。如强酸、强碱等，它们不属于抑制剂。去激活作用:某些酶(金属激活酶)只有在金属离子存在下才能很好地表现其活性,如果用金属螯合剂去除金属离子会引起这些酶活性的降低或丧失.（五）、抑制剂对反应速度的影响8384

不可逆性抑制作用*概念抑制剂通常以共价键与酶活性中心的必需基团相结合，使酶失活，不能用透析、超滤等方法予以除去。

*举例：有机磷化合物羟基酶解毒------解磷定(PAM)重金属离子及砷化合物巯基酶解毒------二巯基丙醇(BAL)

85

有机磷化合物对羟基酶的抑制86

胆碱酯酶乙酰胆碱胆碱+乙酸乙酰胆碱堆积引起付交感兴奋症状：恶心，呕吐，多汗，肌肉震颤，瞳孔缩小87路易士气失活的酶巯基酶失活的酶酸BAL（二巯基丙醇）巯基酶BAL与砷剂结合物88可逆性抑制作用*概念抑制剂以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去。竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制*类型891.竞争性抑制作用定义抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。9091+++EESIESEIEP92竞争性抑制93*特点抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及［S］；I与S结构类似，竞争酶的活性中心；动力学特点：Vmax不变，表观Km↑。抑制剂↑无抑制剂1/v

1/[S]94*举例（1）.丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制琥珀酸琥珀酸脱氢酶FADFADH2延胡索酸95（2）.磺胺药对细菌FH2合成酶的抑制（3）.抗代谢物的抗癌作用:5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤等96972.非竞争性抑制抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间无竞争关系。98非竞争性抑制99*特点抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合；抑制程度取决于［I］；动力学特点：Vmax↓，表观Km不变。抑制剂↑1/v1/[S]无抑制剂1003.反竞争性抑制抑制剂仅与酶和底物形成的中间产物结合，使ES的量下降。101反竞争性抑制102*特点抑制剂只与ES结合；抑制程度取决与［I］及［S］；动力学特点：Vmax↓，表观Km↓。抑制剂↑1/V1/[S]无抑制剂•103各种可逆性抑制作用的比较

作用特征竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制与I结合的组分EE、ESES表观Km增大不变减小Vmax不变降低降低104各种可逆性抑制作用的比较

105（六）、激活剂对反应速度的影响激活剂(activator)使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质。

•酶的激活剂大多是无机离子•必需激活剂(essentialactivator)：对酶促反应是不可缺少的。•非必需激活剂(non-essentialactivator)：激活剂不存在时，酶仍有一定的催化活性。106

5.4酶的调节

TheRegulationofEnzyme

107

催化单向不可逆反应或非平衡反应的酶，一般位于代谢途径的起始或分支处，决定整个代谢的方向和速度；催化反应速度最慢的酶称为限速酶；这类酶受底物的控制，还受多种代谢物或效应剂的调节，是可调节酶。关键酶（KeyEnzyme）：108酶活性的调节（快速调节）酶含量的调节（缓慢调节）调节方式调节对象关键酶109一、酶活性的调节（一）酶原与酶原的激活酶原(zymogen)有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，此前体物质称为酶原。酶原的激活在一定条件下，酶原向有活性酶转化的过程。110赖缬天天天天甘异赖缬天天天天缬组丝SSSS46183甘异缬组丝SSSS肠激酶胰蛋白酶活性中心胰蛋白酶原的激活过程111胰蛋白酶原的激活过程112113酶原激活的机理酶原分子构象发生改变形成或暴露出酶的活性中心一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽在特定条件下114酶原激活的生理意义避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。有的酶原可以视为酶的储存形式。在需要时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。115（二）变构酶（Allostericenzyme）

变构效应剂(allosteric

effector)变构激活剂变构抑制剂变构调节(allostericregulation)变构酶(allostericenzyme)变构部位(allostericsite)一些代谢物可与某些酶分子活性中心以外的部位可逆地结合，使酶构象改变，从而改变酶的催化活性，此种调节方式称变构调节。116

变构酶（Allostericenzyme）变构酶也称别构酶，它是代谢过程中的关键酶(Keyenzyme）。通过效应物（调节物）和酶的别构中心的结合来调节其活性，从而调节酶反应速度和代谢过程。

Allostericenzyme:一种其活性受到结合在活性部位以外部位的其它分子调节的酶，[S]与v作图为S形曲线，并非双曲线。

117118变构调节举例

119变构调节120变构酶的特点①

通常具有四级结构，存在协同效应；②含有催化亚基和调节亚基（或催化部位和调节部位）。

酶分子中除了有结合底物并催化反应的Activecenter外，还有可以结合调节物的Allostericcenter。活性中心和别构中心可能位于不同的亚基或相同的亚基的不同部位。③[S]-v关系曲线为S形。

④变构剂与酶非共价结合。121几个相关概念别构效应（Allostericeffect）：调节物或效应物与酶分子上的别构中心结合后，诱导出或稳定住酶分子的某种构象，使酶活性中心对底物的结合和催化作用受到影响，从而调节酶反应速度及代谢过程，此效应即为酶的别构效应。

协同效应(Cooperativeeffect):一分子L(配体)与E结合后对第二分子L结合的影响。122正协同效应负协同效应同种正协同效应异种正协同效应协同效应异种负协同效应同种负协同效应123别构酶的动力学及别构酶对酶反应速度的调节1.大多数别构酶具有正协同效应（酶分子结合一分子底物或效应物后，酶的构象发生变化，这种新的构象有利于后续分子与酶的结合，大大促进后续分子与酶的亲合性），其初速度与底物浓度的关系呈S形的v-[S]曲线。

当底物浓度发生很小的变化时，别构酶就极大地控制着反应速度。在正协同效应中使得酶反应速度对底物浓度的变化极为敏感。1242.另一类别构酶具有负协同效应，其动力学曲线在表现上与双曲线相似，但意义不同[s]具有负协同效应的酶在底物浓度较低的范围内酶活力上升快，但再继续下去，底物浓度虽有较大的提高，但反应速度升高却较小。使得酶反应速度对底物浓度的变化不敏感正负125区分酶的类型有两种标准（P188）a.Koshland标准：CI（cooperativityindex）协同指数：酶分子中的结合位点被底物饱和90%与饱和10%时底物浓度的比值。亦称饱和比值Rs(saturationratio)

位点被90%饱和时的底物浓度位点被10%饱和时的底物浓度

Rs=81米氏类型酶

Rs81具有正协同效应的别构酶

Rs81具有负协同效应的别构酶b.Hill系数：

Hill系数(n)=1米氏类型酶

Hill系数(n)

1具有正协同效应的别构酶

Hill系数(n)

1具有负协同效应的别构酶Rs=126以[S]对V作图：正调节为典型的S形曲线，大大有利于对v的调节

M氏酶为双曲线，[S]和效应剂浓度变化对v不敏感，无调节作用负调节为近似双曲线

激活剂存在时，S曲线向左移（趋于双曲线），协同效应减弱抑制剂存在时，S曲线向右移（S形加重），协同效应加强无抑制剂和激活剂时，E对[S]变化为S曲线127变构酶常为多个亚基构成的寡聚体，具有协同效应变构激活变构抑制变构酶的Ｓ形曲线[S]V无变构效应剂128变构调节的意义①快速调节；②总产物可抑制该途径起始的酶—反馈抑制，这可保证代谢物生成不致过多，保证能量的有效利用，不致浪费；③使不同代谢途径互相协调。129（三）酶的共价修饰调节共价修饰(covalentmodification)在其他酶的催化下，酶蛋白肽链上的一些基团可与某种化学基团发生可逆的共价结合，从而改变酶的活性，此过程称为共价修饰。常见类型磷酸化与脱磷酸化（最常见）乙酰化和脱乙酰化甲基化和脱甲基化腺苷化和脱腺苷化－SH与－S－S互变130Phosphorylationanddephosphorylation磷酸化去磷酸化131

132共价修饰调节的特点①受共价修饰的酶存在有（高）活性和无（低）活性两种形式；②具有瀑布效应（级联效应）；③调节效率高于别构调节；④磷酸化要消耗ATP;⑤是体内经济、有效的快速调节方式。133级联效应A1AE×10B1BE×100C1CE×1000SP×10000134二酶含量的调节（一）酶蛋白合成的诱导和阻遏诱导作用(induction)阻遏作用(repression)（二）酶降解的调控1351.概念

同工酶是指能催化相同的化学反应，但酶蛋白的分子结构、组成却有所不同的一组酶,一般为寡聚蛋白。2.同工酶举例：1959年，Marker首先用电泳分离法发现动物的乳酸脱氢酶（LDH）具有多种分子形式。LDH5(M4)LDH4(M3H)LDH3(M2H2)LDH2(MH3)LDH1(H4)

三同工酶（Isoenzyme）136

Distribution：Heart－LDH1

Muscle－LDH5137

心、肝病变时引起的血清LDH同工酶的变化规律：

心脏疾病

LDH1和LDH2上升，LDH4和LDH5下降。

急性肝炎

LDH5明显上升，随病情好转而恢复正常。

3.研究同工酶的意义

（1）进行遗传分析、杂种优势的筛选、抗逆指标筛选（2）进行疾病诊断（3）研究代谢规律138临床意义心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶谱的变化1酶活性心肌梗死酶谱正常酶谱肝病酶谱2345139四Ribozyme核(糖)酶Ribozyme是一种RNA生物催化剂Ribozyme的发现：RNA具有酶的催化功能是由CechT.R于1982年提出的。1981年，发现四膜虫（tetrahymenathermophila）的26SrRNA前体在成熟过程中，其居间序列通过剪接反应被除去。并证明四膜虫rRNA前体的居间序列核糖核酸（L-19RNA）具有多种催化功能，将这种具有催化活性的RNA称为Ribozyme(ribonucleicacidenzyme)。获得1989年诺贝尔化学奖。140rRNA基因的转录产物即rRNA前体（大约6400个核苷酸残基）很不稳定，在鸟苷和Mg2+存在下切除自身的内含子（Intron或Interveningsequence,IVS-居间序列或间插序列），使两个外显子(Exon)拼接起来，形成成熟的rRNA_——此过程没有任何蛋白质酶参与，称为自我剪接（Self-splicing）,并证明RNA具有催化活性。141

四膜虫rRNA成熟中RNA的剪接示意图142Ribozyme在一定条件下，高度专一地催化下列反应，具有相应酶的活性（底物专一、符合米氏方程、对竞争性抑制剂敏感）

1.核苷酸转移酶活性2CpCpCpCpCCpCpCpCpCpC+CpCpCpC2.磷酸二酯酶活性CpCpCpCpC

CpCpCpC+Cp3.磷酸转移酶活性CpCpCpCpCpCp+UpCpUCpCpCpCpCpC+UpCpUp4.RNA限制性内切酶活性另外，1997年，Zhang和Cech证明了人工合成的RNA分子具有肽基转移酶活性。143Ribozyme发现的重大意义：RNA具有酶的催化活性，向酶的化学本质是蛋白质这一传统概念提出了挑战。在理论上，对于生物起源和生命进化的研究具有重要启示。

生物催化分子进化的可能性：

RNARNA-蛋白质蛋白质-RNA蛋白质-辅酶或辅基蛋白质在实践上，由于Ribozyme的内切酶活性，可定点切割mRNA，破坏mRNA，抑制基因表达，为基因、病毒和肿瘤治疗提供了可行途径。144根据酶的合成与代谢的关系，人们把酶相对地分为结构酶（structuralenzyme）和诱导酶(inducedenzyme)

结构酶—是指细胞中天然存在的酶，其含量较为稳定，受外界的影响小。诱导酶—指细胞中加入特定诱导物后诱导产生的酶，其含量在诱导物存在下显著增高，这种诱导物往往是该酶底物的类似物或底物本身。如E.Coli培养基中含：葡糖和乳糖—但只有葡糖酵解酶类（结构E）。只有乳糖—开始代谢下降，一段时间后代谢上升，产生了有关半乳糖代谢的三种酶。酶的生成受代谢物和遗传基因的双重控制五诱导酶（Inducedenzyme）145抗体酶—指具有催化活性的免疫球蛋白，即在其高可变区赋予了酶的属性。是抗体的高度选择性与酶的高效催化性相结合的产物。抗体酶的应用前景：

1.为蛋白质结构的研究提供新手段

2.设计抗肿瘤等的新型生物药物3.应用于工业制药（立体专一性抗体酶）六抗体酶（Abzyme）22h2005.10.12146

5.6Enzymeengineering简介1971年第一届国际酶工程会议上得到命名。主要研究：酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造及其在工、农、医药等领域的应用。天然酶在开发和应用方面受到限制：1.酶的不稳定性2.酶的分离、纯化较难，成本高，价格贵

酶工程的概念147目前在酶的应用方面所采取的一般方法：

1.化学方法：通过对酶的化学修饰或固定化处理，改善酶的性质以提高酶的效率和降低成本，或通过化学合成法制造人工酶。2.利用基因重组技术生产酶以及对酶基因进行修饰或设计新基因，生产出性能稳定、具有新的生物活性以及催化效率更高的酶。148

化学酶工程亦称初级酶工程，指天然酶、化学修饰酶、固定化酶及人工模拟酶的研究和应用。

1.天然酶：主要指工业用酶，从微生物发酵得到的酶。如：洗涤剂、皮革生产中用的蛋白酶；纸张制造用的淀粉酶；乳制品用的凝乳酶等。

2.化学修饰酶：用于医药及研究工作。通过（1）

化学修饰酶的功能基；（2）通过交联反应；（3）大分子修饰作用（用葡聚糖修饰SOD增加其半寿期，提高耐热性、耐酸碱性等。用葡聚糖和聚乙二醇修饰尿激酶等）。

3.固定化酶(Immobilizedenzyme)：将水溶性酶用物理或化学方法，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。

4.人工模拟酶—化学法合成酶（已知酶的活性中心和作用机理）。5.6.1化学酶工程1493.固定化酶

1971年在第一届国际酶工程会议上正式采用固定化酶名称酶的固定化方法：物理法：吸附法和包埋法化学法：共价偶联法和交联法目前，我国利用固定化氨基酰化酶拆分DL-AA；固定化的葡萄糖异构酶生产高果糖玉米糖浆；150生物酶工程亦称高级酶工程，是酶学和以DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。生物酶工程的主要内容：克隆酶—用基因工程技术大量生产酶（-淀粉酶，青霉素酰胺酶、亮氨酸合成酶）突变酶—对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶（改变酶的催化活性、底物专一性、最适pH、改变酶的别构调节能力、改变酶对辅酶的要求、提高酶的稳定性）

制造新酶—设计新酶基因，合成自然界不曾有过的酶5.6.2生物酶工程151酶的分离提纯与活力测定酶活力（酶活性，enzymeactivity）是指酶催化一定化学反应的能力。酶量很难用酶的“量”（质量、体积、浓度）来表示。常用酶活力来表示酶量，即酶催化某一特定化学反应的能力。152一．酶活力及其测定在一定条件下酶催化的化学反应速度可反映酶活力。酶促反映速度越大，酶活力越强。酶促反应速度(Eactionrate)可用单位时间、单位体积中底物的减少或产物的增加表示。如用化学滴定、比色、比旋光度、测定紫外吸收、电化学法、气体测定等。由于产物是从无到有，因此一般测定产物的增加。153酶活力测定方法：1、测定一定时间内的化学反应的量在一定时间内,于最适于酶的条件下测定被酶作用的底物减少的量或产物生成的量,通常测定产物生成的量。因为在实验中底物的量一般是过量的，反应