第4章 基因组测序与序列组装

第四章基因组测序与序列组装4.1DNA测序的方法4.2基因组测序与序列组装4.3基因组测序的其他路线4.1DNA测序的方法4.1.1Maxam-Gilbert化学降解法（chemicaldegradationmethod)化学修饰DNA测序法，A.M.Maxam和W.Gilbert于1977年发明。化学降解法主要用于测定短片段DNA的序列例如启动子测序化学降解法测序DNA模板有链内碱基配对时也可用化学降解法测序化学降解法基本原理及步骤

i.首先对待测片段作末端标记，用放射性32P-磷酸基团标记链的末端之一ii.进行四组平行的反应：（G，A+G，C+T以及C）特异性切割

iii.最后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影。比较G、A＋G、C＋T和C各个泳道，自下而上从自显影片上就可读出DNA序列

碱基特异的化学切割反应碱基特异修饰方法GpH8.0,用硫酸二甲酯对N7进行甲基化,使C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子位置脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键C+T肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后易除去C1.5mol/LNaCl存在时,可用肼除去胞嘧啶6DNA标记与分离：先放射性标记DNA链5'端加入二甲基亚砜DMSO,加热到90度，打开双链电泳分离一条链比另一条链嘌呤核苷酸多，跑得慢，称为重链纯化一条链，分成4份，每样都用一种切割试剂处理

7"G"反应加入有限的硫酸二甲酯处理，使每个多聚核苷酸上只能修饰一个G残基加入哌啶使链断裂哌啶首先去除修饰的嘌呤环，并在紧邻所产生的无碱基位点上游的磷酸二酯键出切割DNA8化学降解法缺点：

试剂含有毒性不易自动化4.1.2链终止法（chainterminationmethod)1977年Sanger等人发明了利用DNA聚合酶的双脱氧链终止原理测定核苷酸序列的方法，又称为Sanger双脱氧测序法此法更适合序列分析的自动化最常用的一种测序方法，第一代测序仪采用的方法dNTP与ddNTP的分子结构分别进行反应如何获得单链DNA?1）将DNA克隆到质粒载体中获得测序模板DNA最常用的方法获得的DNA通过热变性或者碱变性转变为单链DNA进行测序优点是可双向测序缺点是样品可能有少量细菌的DNA或者RNA污染，会干扰测序如何获得单链DNA?2）以M13载体克隆单链DNAM13噬菌体载体是专门为得到单链DNA测序模板而设计的。M13噬菌体本来含有单链DNA基因组，感染大肠杆菌的M13可转变为双链复制型。M13噬菌体载体是双链的，相当于M13噬菌体的复制型。用含有待测序片段的M13噬菌体载体感染大肠杆菌，大肠杆菌分泌的噬菌体就含有单链DNA基因组。缺点：只能用于短片段DNA，大于3kb的片段在克隆过程中会发生丢失和重排。如何获得单链DNA?3）以噬菌粒（phagemid)载体克隆DNA这是一种改造过的质粒克隆载体，含有两个复制起点，一个是质粒自身的复制起点，一个是单链DNA噬菌体基因组的复制起点当大肠杆菌细胞中同时含有噬粒和辅助噬菌体时，因为辅助噬菌体携带的编码噬菌体复制酶和外壳蛋白的基因可以激活噬菌粒上的噬菌体复制起始位点，产生含单链的噬粒噬菌体优点：克隆片段可达10kb以上链终止法所用的DNA聚合酶高持续合成能力（processivity)

聚合酶由于自然原因终止反应前所合成的多聚核苷酸的长度无5'→3'外切酶活性无3'→5'外切酶活性目前普遍采用的测序酶为Sequenase,来自T7噬菌体,除具有以上特点，还具有其它特征，比如反应快速引物决定待测模板DNA区域自动化测序是在Sanger双脱氧链终止法的基本原理上发展起来的:

1)荧光染料（fluorescentdye)标记取代了放射性标记,由于由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色，而简化为由1个泳道同时判读4种碱基

2)毛细管(capillarygel)电泳取代了平板胶（slabgel)电泳两种形态的PAGE毛细管电泳有96个泳道，可同时进行96次测序AutomatedDNAsequenceworkflowDNAtemplatepreparationCyclesequencing:384-wellplate,每个well中，加上4种dNTPs和四种带不同荧光标记的ddNTP,测序酶，模板DNA，单侧引物，放于热循环仪（thermocycler)上进行反应

60cycles:95oC30s50oC20s60oC4minAutomatedDNAsequenceworkflow(cont.)ExtensionproductpurificationethanolprecipitationCapillaryelectrophoresisDataanalysis21阅读链终止实验所产生的序列4.1.3焦磷酸测序法（pyrosequencing）也叫454测序技术

不需要克隆得到DNA模板，不需要电泳或其他任何片段分离程序高通量的一种测序方法，一种二代测序技术

2023/2/124硫酸化酶萤光素酶氧化萤光素发出的可见光信号与加入核苷酸数成正比聚合酶5’-磷酰硫酸萤光素加apyrase双磷酸酶降解未反应的dNTPsSecondgenerationsequencers454

SolexaSOLiD50bp/80-100GbDenovosequencingRNA-seq,Re-sequencingChIP-seq，Meth-seqMetagenomicsDenovosequencingRNA-seqRe-sequencingChIP-seqRNA-seq“known”GenomeNovelgenome(s)Bothtypes400bp/400Mb120bp/40-60Gb高通量！第二代测序技术采用了高通量测序技术，使测序通量大大提高，从Sanger测序法一次读取一条序列到毛细管测序的一次读取96条序列再到现在的一次读取几百万条序列的实现，这是对第一代测序技术的一次革命性的变革然而第二代测序技术并不完美，由于其在测序前要通过PCR手段对待测片段进行扩增，因此增加了测序的错误率。并且其测序结果比较短，更适合重测序，而不太适用于没有基因组序列的全新测序。4.1.4第三代测序技术Helicos公司的Heliscope单分子测序仪、PacificBiosciences公司的SMRT技术和OxfordNanoporeTechnologies公司正在研究的纳米孔单分子技术，被认为是第三代测序技术又称为下下一代的测序（next-next-generationsequencing）的直接测序方法这一测序技术是基于纳米孔（nanopore）的单分子读取技术，不同于之前的两代技术,可以直接读取序列信息，简洁快速,成本更低廉2023/2/14.2基因组测序与组装4.2.1一些术语覆盖面（coverage)是指随机测序中获得的序列总长与单倍体基因组序列总长之比，coverage越大，遗漏的序列越少可以用P0=e-m计算，P0为丢失的概率，m为coverage如果m=1，P0=37%m=6,P0=0.25%m=8,P0=0.034%要使测序的覆盖率达到99.99%，就必须使coverage达到8次以上读序（read)

每次测序可获得的DNA序列BAC末端序列(BAC-endsequences)

一个BAC克隆插入片段两端的已测序的序列,不包括内部序列。可用于确定BAC的排列方向以及重叠群(contig)在支架(scaffold)中的排列方向

重叠群（contig)一群相互重叠的克隆或DNA顺序,可以是草图顺序或精确顺序(finished),包括连续的(内部无间隙)或不连续的(内部含间隙)DNA顺序支架（scaffold)一组已锚定在染色体上的重叠群,内部含间隙或不含间隙.草图序列（draftsequence)人类基因组测序计划定义为经PhredQ20软件认可覆盖测序克隆片段3-4倍的DNA顺序.含间隙或无间隙,排列方向和位置未定完成序列（finishedsequence)序列差错率(错误碱基数)低于0.01%的DNA序列,排列方向确定,内部不含间隙,一般coverage达到8-104.2.2克隆重叠群测序与序列组装克隆重叠群测序又称为作图法测序(map-basedsequence)或者克隆依次测序（clone-by-clone)

BAC-by-BACThemappedBAC-by-BACshotgunsequencingstrategyMajorstepsinBAC-by-BACshotgunsequencing(2-4kb)线虫基因组采用克隆重叠群法测序4.2.3鸟枪法测序与序列组装鸟枪法测序

将DNA分子打断成小片段，测定每一段的序列，根据每个片段的重叠部分再组装成主体序列可以不需要事先了解基因组信息，不需要构建遗传图或物理图，但不适合大基因组

全基因组鸟枪法测序应用图谱帮助主要序列组装鸟枪法测序实例-流感嗜血杆菌序列测定1）建立高度随机、插入片段大小为2kb左右的基因组文库。克隆数要达到一定数量，即经末端测序的克隆片段的碱基总数应达到基因组5倍以上。2）高效、大规模的末端测序。对文库中每一个克隆，进行两端测序，流感嗜血杆菌基因组的测定完成，使用了14台测序仪，用三个月时间完成了必需的28,643个测序反应，测序总长度达6倍基因组,得到140个contigs3)填补缺口。

42个物理间隙和99个序列间隙，建立插入片段为15-20kb的λ文库以备缺口填补序列间隙（sequencegap)

测序时遗漏的序列，这些序列仍然保留在尚未挑选到的克隆中可以通过利用相邻已知顺序作为探针，筛选已有的基因组文库，挑选阳性克隆重新测序关闭间隙

物理间隙（physicalgap)建基因组文库时丢失的DNA序列，即基因组文库中没有这些序列的克隆物理间隙的填补需要利用其他载体或者宿主菌重新构建一个基因组文库，然后利用间隙两侧的序列作为探针，或者制备相应的PCR引物，从新文库筛选阳性克隆，重新测序高度重复序列造成的gap很难填补全基因组鸟枪法序列组装过程利用插入片段大小不同的克隆两端测序搭建支架4.2.4人类基因组测序与组装序列草图是采用物理图与鸟枪法有机结合的技术路线完成的采集5个自愿者的DNA样品构建3种不同插入子大小的基因组文库2Kb,10Kb和50Kb完成约2700万次插入子末端测序,总长14800MbGeneBank下载104018个BAC末端顺序PFP发表的公开数据主要为BAC克隆的顺序,共4443.3Mb全基因组序列组装方法和区间化组装相结合进行序列组装Celera

genomics人类基因组的测序策略国际人类基因组测序策略

构建BAC克隆↓限制性酶处理获得指纹↓根据指纹重叠方法组建BAC克隆重叠群