动物细胞工程

2.2动物细胞工程动物细胞培养技术动物细胞融合技术单克隆抗体技术动物细胞核移植技术动物细胞工程常用技术（基础）植物细胞工程常用技术植物组织培养技术植物体细胞杂交技术一、动物细胞培养技术2.2.1动物细胞培养和核移植技术从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。1、概念及原理原理:细胞增殖（有丝分裂）选材：

动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，它们比老龄动物的组织细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养。分散成单个细胞：在进行动物细胞培养时，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。植物组织培养选择离体的植物器官、组织或细胞2、动物细胞培养过程胚胎或幼龄动物的组织器官细胞悬液10代细胞50代细胞剪碎重新用胰蛋白酶处理，分瓶继续培养细胞增殖缓慢，核型可能发生变化细胞贴壁10代以内，保持正常二倍体核型传代培养胰蛋白酶（分解弹性纤维等蛋白质）接触抑制分散成单个细胞加培养液稀释放入培养瓶中培养继续传代培养时，少部分细胞发生癌变细胞株细胞系原代培养简述动物细胞培养的操作过程分离组织（低幼动物）分散细胞（胰蛋白酶）原代培养（细胞增殖）传代培养（细胞增殖）分装动物细胞培养不能最终培养成生物体3、动物细胞培养条件：（1）无菌、无毒的环境

无菌处理，添加一定量的抗生素，定期更换培养液（2）营养（培养基）

葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、血清、血浆等。（3）温度和PH

36.5±0.5℃,7.2～7.4（4）气体环境

O2和CO2（95%空气和5%CO2）O2是细胞代谢所必须的，CO2主要作用是维持培养液的PH4、动物细胞培养应用大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体）皮肤移植材料的培育作为基因工程中的受体细胞培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据细胞的全能性细胞株、细胞系植物体培养结果获得细胞或细胞产物（细胞分泌蛋白）快速繁殖、培育无病毒植株等培养目的葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素培养基特有成分液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖原理动物细胞培养植物组织培养比较项目植物细胞培养和动物细胞培养的比较1.关于动物细胞培养的有关叙述，正确的是()A.细胞的癌变发生于原代培养向传代培养的过渡过程中B.动物细胞培养液中通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、生长素和动物血清等C.动物细胞培养的目的只是获得大量的细胞分泌蛋白D.动物细胞培养前和培养过程中都要用胰蛋白酶处理D

2、下列属于动物细胞培养与植物组织培养主要区别的是

A.培养基成分不同

B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行

C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能

D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株A愈伤组织条件适宜可以传代培养不分化。3.回答下列有关动物细胞培养的问题：⑴在动物细胞培养的过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面

时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的

。此时，瓶壁上形成的细胞层数是

，要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是

。

⑵随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现

的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成

细胞，该种细胞的黏着性

，细胞膜表面蛋白质（糖蛋白）的量

。相互接触单层胰蛋白酶衰老甚至死亡接触抑制不死性降低减少

⑷检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选用细胞分裂到

期的细胞用显微镜进行观察。⑸在细胞培养过程中，通常在

条件下保存细胞，因为在这种条件下，细胞中

的活性降低，细胞的

速率降低。⑹给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤组织当作

进行攻击

。中冷冻酶新陈代谢抗原

细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上细胞要贴附于底物上才能生长增殖细胞要能够贴附在底物上才能生长繁殖，所以要求培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。

要求：接触抑制：细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。50代以后失去接触抑制接触抑制动物细胞生长特性部分细胞突变，获得不死性，向癌细胞方向发展，糖蛋白减少。原代培养：传代培养：单个细胞10代左右原代培养细胞40~50代左右

从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶等处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖，这样的培养过程称为传代培养。

细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40～50代，这种传代细胞为细胞株。

细胞系：细胞株传代至50代后少部分细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正在朝着等同于癌细胞的方向发展。这种传代细胞为细胞系。

细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。10代～50代细胞，遗传物质没发生改变50代以后的细胞，遗传物质发生改变，可无限增殖将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。核移植（难度高）胚胎细胞核移植：体细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全能性容易二、动物细胞核移植技术分化程度高，移植成活率低2、分类1、概念3、体细胞核移植技术过程取供体细胞取卵母细胞

供体细胞培养培养到MⅡ期

卵母细胞去核

供体细胞注入去核的卵母细胞

两细胞融合，核进入受体卵母细胞

重组胚胎

代孕母牛

生出与供体遗传物质基本相同的个体动物细胞培养技术（受体细胞）显微操作技术体细胞核移植技术细胞融合技术胚胎移植技术高产奶牛１、在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？为使核移植动物的遗传物质最大程度来自有利用价值的动物提供的细胞。２、用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，为什么？10代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，未发生突变。P49讨论题3、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？不是，克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞核，但核外还有少部分DNA（如线粒体DNA）来自受体卵母细胞。思考题卵细胞苏格兰黑面母羊芬兰白面母羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎另一头母绵羊子宫胚胎移植多莉羊多莉羊的培育过程重组细胞电脉冲刺激1、对比多莉羊和课本高产奶牛的克隆过程，找出操作过程的不同点？多莉克隆过程的受体细胞是去核卵细胞，而高产奶牛的克隆过程的受体细胞是去核卵母细胞；多莉克隆过程是将供体细胞核注入受体细胞，而高产奶牛的克隆过程是将供体细胞注入受体细胞。2、讨论分析上述哪一种措施更科学？并说明理由？卵母细胞当中的细胞周期蛋白含量、活性比卵细胞高，用它作受体更容易成功；将供体细胞注入受体细胞，使克隆动物更像供体动物，操作也方便。思考题3、动物的克隆与植物组织培养一样吗？4、用动物体细胞进行克隆的过程,其实际操作过程是什么？动物克隆过程的实际是细胞核移植不思考题4、体细胞核移植技术的应用前景1、加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育2、保护濒危物种，增加存活数量3、转基因克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白4、可以作为异种移植的供体，可以用于组织器官的移植成功率非常低绝大多数克隆动物存在健康问题对克隆动物食品的安全性问题也存在争议5、体细胞核移植技术存在的问题动物细胞培养技术动物细胞融合技术制备单克隆抗体技术动物细胞核移植技术动物细胞工程常用技术1.原代培养与传代培养有何区别?2.哪些细胞会失去接触抑制？3.为什么要将组织分散成了单个细胞再进行培养？将动物组织消化后的初次培养就是原代培养。当原代培养的细胞贴满瓶壁后，用胰蛋白酶处理，制成细胞悬浮液后再次分瓶继续培养就是传代培养。①单个细胞容易和周围环境进行物质交换——获得营养物质、氧气等，排出代谢废物；②分散成单个细胞培养能使细胞水平操作的其他技术得以实现。

肿瘤细胞1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是--------------------（）

A．细胞系B．细胞株

C．原代细胞D．传代细胞2、动物细胞工程技术的基础是------（）

A.动物细胞融合B.单克隆抗体

C.胚胎移植D.动物细胞培养

AD3、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞（）

A.容易产生各种变异B.具有更强的全能性C.取材十分方便D.分裂增殖的能力强D4、一般说来，动物细胞体外培养需要满足以下条件（）①无毒的环境②无菌的环境③培养基需要加入血清④温度与动物体温相似⑤需要O2，不需要CO2⑥CO2能调节培养液PHA、①②③④⑤⑥B、①②③④C、①③④⑤⑥

D、①②③④⑥D

5、动物细胞培养的特点（）①细胞贴壁②有丝分裂③细胞分化④接触抑制⑤减数分裂⑥原代培养一般传1－10代A、①②④⑥

B、②③④⑤C、①③④⑥

D、③④⑤⑥A1.体细胞核移植获得高产奶牛过程中，利用了哪些现代生物技术手段？2.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？动物细胞培养技术、亚显微操作技术、核移植技术、胚胎移植技术、细胞融合技术否。绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。3.无性繁殖和有性繁殖的主要区别是什么？4.什么是病毒的灭活？有性繁殖是通过产生有性生殖细胞——配子（包括精细胞、卵细胞），配子结合后生长成新的个体。无性繁殖是不经生殖细胞结合的受精过程，由母体的一部分直接产生子代的繁殖方法。灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。5.灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。1.一只羊的卵细胞核被另一只羊的体细胞核置换后，这个卵细胞经过多次分裂，再植入第三只羊的子宫内发育，结果产下一只羊羔。这种克隆技术具有多种用途，但是不能A．有选择地繁殖某一性别的家畜B.繁殖家畜中的优秀个体C．用于保存物种D.改变动物的基因型D3.下列哪一项属于克隆？A.将鸡的某个DNA片段整合到小鼠的DNA分子中B.将抗药菌的某基因引人草履虫的细胞内C.将鼠骨髓瘤细胞与经过免疫的脾细胞融合成杂交瘤细胞D.将某肿瘤细胞在体外培养繁殖成一个细胞系D2.科学家将雌黑鼠乳腺细胞的细胞核移入白鼠去核的卵细胞内，待发育成早期胚胎后移植入褐鼠的子宫，该褐鼠产下小鼠的体色和性别分别是A.黑、雌B.褐、雌C.白、雄D.黑、雄A动物细胞培养技术动物细胞融合技术制备单克隆抗体技术动物细胞核移植技术动物细胞工程常用技术

“番茄—马铃薯”（理想图）通过长期的实验，科学家们采用体细胞杂交技术获得了“番茄—马铃薯”植株。杂种植株融合的原生质体AB再生出细胞壁脱分化愈伤组织再分化过程植物细胞A原生质体B原生质体A杂种细胞AB去壁去壁人工诱导方法？植物细胞B植物体细胞杂交技术纤维素酶、果胶酶等物理法：离心、振动、电激等化学法：聚乙二醇等试剂筛选如果将奶牛的细胞与植物细胞杂交，得到绿色的小奶牛，那岂不是只要晒晒太阳就可以挤出牛奶吗？动物细胞也能融合吗？动物细胞的全能性会随着动物细胞分化程度的提高而逐渐受到抑制，分化潜能逐渐变弱思考题1.植物体细胞杂交时首先应用什么方法去掉细胞壁？

酶解法，如纤维素酶或果胶酶2.动物细胞融合时需要进行去壁处理吗？为什么？无需，因为动物细胞无细胞壁3.植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？离心、振动、电激等物理方法；聚乙二醇等化学方法4.动物细胞融合能利用上述两类方法吗？还有其他方法吗？能还可以利用灭活的病毒进行诱导5.植物体细胞杂交应先进行原生质体的融合再进行组织培养形成完整的杂种个体，动物细胞融合后能形成杂种动物个体吗？不能，只能形成杂种细胞可用胰蛋白酶将细胞分散三、动物细胞融合技术1.概念：

动物细胞融合（cellfusion）也称为细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传物质的单核细胞，称为杂交细胞。结果：“2个或多个动物细胞”→“1个杂交单核细胞””2、诱导方法物理法：离心、振动、电激化学法：聚乙二醇（PEG)生物法：灭活的病毒病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程细胞核病毒颗粒细胞核

灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接细胞融合，形成单核杂种细胞原理：细胞膜具有一定的流动性4、过程：动物细胞A动物细胞B诱导，融合杂交细胞AB核融合发生在有丝分裂过程中（膜融合、质融合、核融合）注意：动物细胞的融合也需要把多个两种细胞放在一起，让它们随机融合后，再从中筛选杂交细胞。3、原理：细胞膜的流动性6、应用：成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。特别是利用杂交瘤技术制备单克隆抗体。5、意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合细胞融合原理细胞融合前的处理诱导方法结果用途、优点意义细胞膜的流动性、细胞的全能性细胞膜的流动性去除细胞壁后诱导原生质体融合使细胞分散后诱导细胞融合物理（离心、振动、电刺激）化学（PEG）物理、化学方法灭活的病毒培育新品种制备单克隆抗体、病毒疫苗、干扰素等形成杂种植株形成杂种细胞，生产细胞产品突破有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能1、在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是A．诱导融合的方法完全相同B．所用的技术手段完全相同C．所采用的原理完全相同D．都能形成杂种细胞D2、下列关于动物细胞融合，叙述正确的是A．动物细胞融合后形成的具有原来两个或多个动物细胞遗传信息的双核或多核细胞称为杂交细胞B．原理是细胞的全能性C．打破生殖障碍，使远缘杂交成为现实D．常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、离心等3、动物细胞融合的目的中最重要的是A.克服远缘杂交不亲和B.制备单克隆抗体C.培育新品种D.生产杂种细胞DB1.什么是抗体？2.主要分布在哪里？3.由什么细胞产生提问？抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。四、制备单克隆抗体技术主要分布在血清中，也分布于组织液及外分泌液中。抗体抗原B淋巴细胞刺激增殖分化效应B细胞（浆细胞）分泌每一个浆细胞只能分泌一种抗体4.传统抗体的生产方法及缺陷？反复注射抗原克隆单一的效应B细胞不能无限增殖产量低、纯度低抗体特异性差①设计方案：一个B淋巴细胞——只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞——能无限增殖米尔斯坦和科勒杂交瘤细胞②制备过程：继承了双亲细胞的遗传物质：5.单克隆抗体的制备既能无限增殖，又能产生特异性抗体注入小鼠细胞融合分离抗原注入小鼠体内骨髓瘤细胞细胞培养选择培养细胞培养基体内培养体外培养从腹水提取从培养液提取经过免疫的B淋巴细胞杂交瘤细胞单克隆抗体抗原（羊的红细胞）注射到小鼠体内获取经过免疫的B淋巴细胞小鼠骨髓瘤细胞融合灭活的病毒、PEG多种杂交细胞选择性培养基杂交瘤细胞抗体阳性检测足够数量的、能产生特定抗体的杂交瘤细胞群体外培养注射到小鼠腹腔培养液小鼠腹水单克隆抗体抗原-抗体特异性结合的原理克隆化培养5.单克隆抗体的制备筛选制备单克隆抗体过程中两次筛选第一次筛选是将未融合的B淋巴细胞、骨髓瘤细胞以及BB融合、瘤瘤融合的细胞通过选择培养基淘汰，筛选出杂交瘤细胞。第二次筛选是将产生特定抗体的杂交瘤细胞通过细胞培养用相应抗原检测的办法筛选出来。因为从体内取免疫过的B淋巴细胞时可以取出很多种，因此形成的杂交瘤细胞也有很多种，所以需筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞。骨髓瘤细胞免疫小鼠单克隆抗体筛选克隆、筛选体内培养体外培养B淋巴细胞（选择培养基）（抗体检测）细胞融合杂交细胞优点：特异性强，灵敏度高，产量大经过免疫杂交瘤细胞

①作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质，并与特异性结合②用于运载药物：制成“生物导弹”治疗疾病：主要用于癌症治疗6.单克隆抗体的应用既不损伤细胞，又减少了用药剂量，疗效高、毒副作用小的新型药物优点：准确、高效、简易、快速动物细胞融合技术制备单克隆抗体技术过程：不同的动物细胞杂交细胞原理：

.应用：主要用于制备

。

制备：获取

细胞和骨髓瘤细胞融合、筛选

细胞动物细胞培养提取单克隆抗体应用：作为

，用于治疗疾病或运载药物。

诱导剂细胞膜的流动性单克隆抗体B淋巴杂交瘤生物导弹课堂小结：1、单克隆抗体是指（）

A.单个骨髓瘤细胞增殖产生的抗体

B.单个B淋巴细胞增殖产生的抗体C.单个杂交瘤细胞增殖产生的高度单一的抗体D.单个抗体通过克隆化，产生大量抗体C2、“生物导弹”是指（）

A.单克隆抗体B.杂交瘤细胞C.产生特定抗体的B淋巴细胞

D.在单克隆抗体上连接抗癌药物

D练一练3.单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）①淋巴细胞②B淋巴细胞自身融合细胞③小鼠骨髓瘤细胞④骨髓瘤细胞自身融合细胞⑤杂交瘤细胞

A.②④B．①③⑤C.①②③④

D．②③C4.生产单克隆抗体时，在培养基中加入某种试剂能筛选出杂交瘤细胞，该试剂的作用是

A．能选择性抑制骨髓瘤细胞的DNA复制

B．能阻止淋巴细胞的原癌基因被激活

C．能抑制淋巴细胞的DNA复制

D．能阻止杂交瘤细胞核糖体上所有蛋白质的合成A5．在现代生物科技的应用中，需要进行检测与筛选的是（双选）(

)A．对植物的离体组织进行培养，大规模培育优良品种B．将鼠的骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，制备单克隆抗体C．利用人的皮肤细胞进行体外培养，解决自体移植皮肤不足的问题D．将抗虫基因导入植物细胞，培育具有抗虫特性的新植株植物组织培养技术动物细胞融合技术动物细胞培养技术基因工程BD6.如下图所示细胞是经HAT培养基筛选出的能产生单克隆抗体A的杂交瘤细胞，关于该细胞中标出的三个基因的开闭状态，下列说法正确的是A．其中有一个是打开的，即A抗体基因

B．其中有两个是打开的

C．其中有一个是打开的，即ATP合成酶基因

D．其中三个都是打开的B7.下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌抗体的实验方案2、该方案能达到预期效果吗？为什么？4、图中B为________过程，常用_________作为诱导剂，该细胞