动物模型的建立与应用2012(2)肿瘤动物模型

肿瘤动物模型

解放军总医院动物中心陈华Email:chenhua@301tel言肿瘤，尤其是恶性肿瘤，是目前世界上危害人类生命健康最严重的一种疾病。全世界每年大约有1/1000的人罹患癌症，约500万人死于恶性肿瘤。在有些国家，肿瘤已占据死亡原因的第二位，甚至第一位。在医学领域，肿瘤一直是世界范围内受到广泛重视的研究课题。引言肿瘤研究，一般分为基础研究和临床研究两大类。基础研究，又分为分子水平、细胞水平和整体水平的研究。利用实验动物进行整体水平的肿瘤研究，通常称为实验肿瘤学研究。实验肿瘤学研究，不仅与分子水平、细胞水平的研究密切联系，而且对人类肿瘤的预防和治疗有更直接的指导意义和参考价值。肿瘤动物模型自发性肿瘤动物模型诱发性肿瘤动物模型移植性肿瘤动物模型遗传修饰动物与实验肿瘤学研究一、自发性肿瘤动物模型实验动物不经人为的实验处理而自然发生的一类肿瘤，称为自发性肿瘤。自发性肿瘤发生的类型和发病率可随实验动物的种属、品种及品系的不同而异。在实验肿瘤研究中，一般选用高发病率的动物肿瘤模型作为研究对象。常用肿瘤模型小鼠的肿瘤自然发生率肿瘤名称品系年龄(月)性别自发率(%)乳腺肿瘤肺腺瘤肺细胞瘤肝癌淋巴瘤网织细胞瘤垂体肿瘤卵巢肿瘤纤维肉瘤

C3HA/HeC3H/HeC3H/He/OlaAKRAKR(C57BL×C3H/Anf)F1C57BR/CdDBABALB/c(BALB/c×C57BL/6)F1/181414//301212～18/18♀♂♀♂♂/♂♀♀♂♀//♀80～10090.085.085.079.792.049.033.055.575.828.4自发性肿瘤动物模型的优点动物自发性肿瘤是近似人类肿瘤发生学的模型，其肿瘤发生学及细胞动力学特点与人类肿瘤较接近；这类模型便于进行慢性治疗试验，自发性肿瘤与移植性肿瘤相比，对药物的敏感度不太高，疗程长，便于进行综合治疗，对白血病模型，还可以通过血液学检查来评价诱导缓解和维持缓解的治疗方案；这类肿瘤发生的条件比较自然，有可能通过细致的观察和统计分析而发现原先没有发现的环境致癌因素或其他致癌因素，可以着重观察遗传因素在肿瘤发生上的作用。自发性肿瘤动物模型的缺点肿瘤的发生情况参差不齐，而且很难在短时间内获得大量的肿瘤学材料，观察时间可能较长，实验耗资较多，通常动物个体之间肿瘤的生长速度差异较大，难于评价治疗效果。二、诱发性肿瘤动物模型化学药物诱导法最常用；常用的实验动物为大鼠，也有应用其它动物（小鼠、豚鼠、兔、旱獭、犬、恒河猴等）常用大鼠化学致癌剂诱发的肿瘤模型致癌物

给药方式

剂量

诱发时间（天）肿瘤种类

发生率

苯并芘皮肤涂抹；皮肤滴落0.1%，1次/周;0.5%，5次/周120-200150-200多发性乳头瘤和癌;孤立的乳头瘤和癌>90%>90%二甲基苯蒽和巴豆油皮肤涂抹0.15ug/只,2次/周；0.5mg/只,5次/周90-150多发性乳头瘤和癌>90%苯并芘皮下5mg/只，共1次90-120局部纤维肉瘤>90%4-二甲氨基胝口服每天1.5mg/kg350-400外耳道癌>90%7,12-二甲基苯蒽静脉生后第48,50和52天，8mg/kg-100乳腺癌>90%常用大鼠化学致癌剂诱发的肿瘤模型（续）致癌物给药方式剂量诱发时间（天）肿瘤种类发生率二乙基亚硝胺口服5mg/kg，2次/周，共14周120-180恶性肝肿瘤>90%乙基苯基亚硝胺口服每天1mg/kg180-250食管癌>80%N-亚硝基-甲基-乙酰氧基-甲胺口服3.5mg/kg，2次/周，共10周80-120前胃乳头状瘤和癌>90%N-甲基亚硝基脲静脉生后第50和57天，50mg/kg-100乳腺癌>90%诱发性肿瘤动物模型的特点接近于人类肿瘤的发病特点和过程；肿瘤病因学研究起到重要作用；诱导时间长（3～5月，甚至1～2年），动物死亡率高；肿瘤出现的时间、部位、病灶数等在个体之间表现不均一。三、移植性肿瘤动物模型移植性肿瘤是一个动物的肿瘤被移植到另一个或另一种动物身上，经过传代后，它的组织类型与生长特性（包括接种成活率、生长速度、自然消退率、宿主反应及宿主寿命等）已趋稳定，并能在同系或同种受体动物中继续传代，即成为一个可移植的瘤株。一般经过20代的连续接种，可达到这种稳定。移植性肿瘤动物模型分为同种动物移植性肿瘤和异种动物移植性肿瘤两大类。同种动物移植性肿瘤模型由于肿瘤组织的异质性，尽管临床研究有精心的设计、精心护理和精心的结果处理，但却经常难以有把握地证明一种治疗方式比另一种优越，而这些实验观察往往需要很长的时间。如果利用动物移植性肿瘤模型，在短短的12天就可完成一次典型的药效试验，按国家卫生部《新药临床前研究指南》的要求，重复3次，则一个多月即可判定一种药物是否有抑制肿瘤生长的作用。在这些模型上得出的结果，很大一部分与实际是相符的，因此，尽管移植性肿瘤已有很长的发展历史，但目前仍然是抗癌药物体内筛选的重要手段同种动物移植性肿瘤模型目前临床上所用的抗肿瘤药物中，大多数是经动物移植性肿瘤治疗试验而筛选出来的。移植性肿瘤的研究最早见于1889年，至今已发现500多个动物移植性肿瘤的瘤株，但常用的只有40余种，国内常用的有10余种。一般药物筛选要求选用3个瘤株，美国国立癌症研究所（NCI）80年代推荐采用P388（小鼠白血病）、L1210（小鼠白血病）、B16（小鼠黑色素瘤）、C26（小鼠结肠癌）、C38（小鼠结肠癌）、3LL（小鼠Lewis肺癌）及CD8F1（小鼠乳腺癌）。肿瘤名称及类型代号宿主取瘤时间接种量接种方法艾氏腹水癌EACKM小鼠或其它小白鼠6-9d0.2ml（1:1-4）ip肉瘤180S180同上7-11d0.2ml（1:3-4）Sc或ipLewis肺癌LewisC57BL/6小鼠10-14d0.2ml（1:1-3）或直径2-3mm瘤块1块sc黑色素瘤B16B16同上15-20d0.2ml（1:1-3）或直径2-3mm瘤块1块sc白血病L615L615615小鼠6-7d0.1-0.2mlsc白血病P388P388DBA/2小鼠6-8d0.2ml（1:3-4）ip或sc白血病L1210L1210同上同上同上同上瓦克氏肉瘤W256W256Wistar大鼠或其它大白鼠同上0.2-0.5ml（1:3）sc或im动物移植性肿瘤的移植方法⑴取瘤在不损伤肿瘤的前提下，处死供瘤动物，无菌条件下采取肿瘤。实体瘤注意无菌剥离，取无坏死的、生长良好的瘤组织；腹水瘤最好腹部消毒后，将吸取部位的腹部皮肤与肌膜剥离开，以保证无菌吸取含瘤细胞的腹水。⑵接种实体瘤传代大多数都是在皮下进行的，多数在腋窝或颈背部，也可以在大腿的肌肉内接种。肿瘤组织可以以细胞悬液或肿瘤匀浆进行接种，也可以剪成肿瘤小块，以套管针移植，注意每个小块尽量大小一致。动物移植性肿瘤的移植方法⑵接种腹水瘤一般直接以不同浓度的瘤液直接接种，可以接种到皮下形成实体瘤，也可以接种于腹腔，仍长成腹水癌。肿瘤细胞悬液或腹水一般接种0.2ml，以生理盐水，后者常以含葡萄糖的平衡盐水（如Hanks氏液，Gey氏液等）以1：1～4的比例稀释后再接种，一般1只供瘤动物可以接种60只受体动物。为了保证较好的成活率，重要的是无菌操作和快速操作，一般从供瘤动物的处死，到把瘤细胞接种给受体动物，不应超过30分钟。动物移植性肿瘤的移植方法⑶治疗效果评价①实体瘤效果评价：停药次日（或停药1～5d）处死动物，先称体重，后解剖皮下瘤块称重。实体瘤的疗效以瘤重抑制率表示，计算方法如下：瘤重抑制率%=（1－T/C）×100%中草药抑制率30%，合成药40%，并经统计学处理，治疗组与溶剂对照组有显著差异时，认为有苗头，需继续重复，连续3次，疗效稳定，则评定此药有一定疗效。如果对照组小鼠肿瘤平均重量小于2g，表示肿瘤生长不良。在治疗期间，给药组小鼠死亡超过20%，或平均体重（去瘤后）下降（自身对照）超过15%者，表示药物有毒性反应，应当减少剂量重新试验。动物移植性肿瘤的移植方法⑶治疗效果评价②腹水瘤治疗效果评价：疗程结束后次日称体重，逐日记录，分别记录对照组与治疗组的平均生存时间，按下列公式计算生命延长率：生命延长率=（T/C－1）%非腹腔注射给药时，生命延长率50%，或腹腔注射给药时生命延长率75%，并经统计学处理，治疗组与对照组差异显著时，认为有苗头，需继续试验，连续3次，疗效稳定，则评定此药有一定疗效。对照组动物通常在2～3周内全部死亡，个别存活时间太长者需剔除，但各组亦应同时相应地剔除一只。如果治疗期间对照组动物于7天内死亡≥20%，表示肿瘤接种有问题，实验失败；如果对照组内20%的动物存活4周以上，实验亦应作废。治疗组观察时间一般60d（生存超过此时限者，仍按60d计算）。动物移植性肿瘤模型的特点模型复制简便，肿瘤和荷瘤动物较一致；接种成活率高；生长特性与人体肿瘤有差别。人体肿瘤的异种移植模型建立异种可移植性肿瘤模型的最终目的是提供人类肿瘤的体内研究手段，以便于直接研究人类肿瘤的生物学特性及其发病机制。现在主要利用免疫缺陷动物，将人类的肿瘤组织或细胞系移植于免疫缺陷动物体内，建立异种可移植性瘤株。人体肿瘤的异种移植模型利用动物移植性肿瘤来检验抗肿瘤药物的治疗效果，主要是根据药物对动物肿瘤细胞的杀伤作用，但是，动物移植性肿瘤增殖迅速，而且在组织学和细胞动力学方面都与人体肿瘤不一致。将人体肿瘤移植于免疫缺陷的动物体内，因为保持着人体肿瘤的组织学、免疫学及生物学特性，用于研究药物对人体肿瘤的作用，特别是对某种具体肿瘤的敏感性等方面引起人们的广泛重视。裸小鼠现在，已成功地将结肠癌、乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、淋巴瘤和白血病、胃癌、肾癌、宫颈癌、软组织肉瘤和骨肉瘤等移植于裸鼠，并且获得了一定比例的（37.5%）存活肿瘤，还可传代。若用已建株的人体肿瘤组织培养细胞作移植材料，接种后的成活率更高。裸小鼠模型可以用作致癌机制研究，用作肿瘤组织的发生、免疫学、细胞动力学等肿瘤基础理论的研究，以及抗肿瘤药物的敏感性试验等多方面的研究。裸大鼠可以生长于裸大鼠的移植人癌有黑色素瘤、恶性胶质瘤、结肠癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌以及外阴癌、宫颈癌等癌瘤。大多数人癌移植后，可见自行消退，仅少数肿瘤呈进行性生长。其自行消退的原因尚不十分清楚。裸大鼠的发现及人癌异种移植的成功，给肿瘤和免疫研究增添了一个新的手段。由于以裸大鼠代替裸小鼠，具有移植瘤大、取血量多、可施行某些外科小手术等优点，比裸小鼠具有一定的优越性。SCID小鼠1983年Bosma等首次报道了小鼠的严重联合免疫缺陷（severecombinedimmuno-deficient,SCID）突变，纯合scid基因导致T、B淋巴细胞不能分化为特异性功能淋巴细胞，此突变型小鼠T、B淋巴细胞功能缺陷，NK细胞及巨噬细胞功能正常。人类实体瘤移植SCID小鼠，为深入探索人类恶性肿瘤的发生机理、生长转移规律及治疗方法提供了良好的活体模型。与裸小鼠比较，SCID小鼠能够接受的肿瘤种类广泛，生长良好，转移广泛。人类肿瘤异种移植模型的特点移植瘤保持着原发肿瘤的大部分生物学特性；几乎所有类型人类肿瘤均能在免疫缺陷动物体内建立可移植性肿瘤模型；已将裸基因导入21个近交系小鼠，可为异种肿瘤移植研究提供丰富的遗传背景；人体原发肿瘤的所有细胞亚群不能全部出现在移植瘤中；肿瘤组织的间质有来源于免疫缺陷动物的成分；四、基因修饰动物与肿瘤研究随着人们对癌基因的激活和/或抑癌基因失活在肿瘤发生发展中的作用认识的日益深入，以及近年发展起来的在小鼠生殖系引入可诱导或精细调控突变技术的应用，基于此肿瘤小鼠模型建立工作取得突破性进展。人们建立了大量的癌基因和肿瘤相关基因的转基因动物模型，也通过在动物整体敲除这些基因研究它们在肿瘤发生发展过程中的作用。转基因动物与肿瘤研究目的基