微生物检验实验室菌种保存程序

微生物检验实验室菌种保存程序1．目的规范菌种保存程序。2．范围微生物实验室保存的标准菌种和来自临床的标本菌株3．职责微生物实验室检验人员正确执行本程序。4．程序4.1需氧菌保存法4.1.1一般保存法见表6-1表6-1常见菌种培养基保存期限菌种培养时间培养基保存温度保存时间流感嗜血杆菌18-24脱纤维羊血或脱脂牛奶-206个月葡萄球菌、链球菌18-24血琼脂斜面（高层加液体石蜡）4—81—3年肠杆菌科18-24Soxbean酪蛋白琼脂（高层加液体石蜡）4—81年肠杆菌科、非发酵菌、葡萄球菌等18-24牛肉汤（6份苛养菌18-245%小牛血清肉汤-206个月4—83个月-706年4—83个月-706年幽门螺杆菌18-24心脑浸液或布氏肉汤加入甘油注：保存郡主均需培养18~24h。4.1.2冷冻干燥法将待保存菌培养18~24小时后，挑取菌落加入一定量的牛肉汤或心脑浸出液加入20%的蔗糖，混匀，分装于安瓿中，置70°C低温冰箱中迅速冻结，再放入冷冻干燥机内，抽真空16~24小时，然后将安瓿封口，置低温冰箱保存。大多数菌株可保存10年以上，甚至更长。4.1.3超冰冻法保存菌株初代培养18~24小时的菌落、菌苔，加入0.5~1.0ml无菌脱纤维羊血安瓿中，封口，置液氮或-40C冰箱中保存。4.2厌氧菌保存法短期保存方法疱肉培养基保存法用牛肉渣和牛肉浸出液制成疱肉培养管，接种待保存菌株，然后覆盖1~2cm的石蜡，再将培养管垂直放置片刻，待石蜡凝固置35C培养（无芽胞厌氧菌培养72小时，普通梭菌培养24小时，产气荚膜梭菌和多枝梭菌培养2周左右），最后置室温或-20C保存。发酵糖类的厌氧菌每个月转钟1次，不发酵糖类的厌氧菌3~6个月转钟1次。半固体培养基保存法在上述液体培养基中加入.0.2%~0.5%琼脂，制成半固体培养基，接种时用毛细管将待保存的厌氧菌的菌液加入半固体培养管底，表面加入1~2cm厚度的液体石蜡，密封管口，培养48小时，置室温或-20°C保存。甘油乳剂培养基保存法在厌氧液体培养基（含胰蛋白胨、牛肉膏、酵母浸液、L-半胱氨酸和维生素K等）中加入少量牛肉渣分装于长试管中，接种待保存菌株，置35C培养48~72小时，取出后加入无菌甘油（按1:1比例），盖紧盖子后用石蜡封口，置4C或-20C保存。此法适用于保存脆弱拟杆菌、产黑色素普雷沃菌和具核梭杆菌。4.2.2长期保存法低温冷冻保存法（厌氧菌在低温条件下新陈代谢处于抑制状态，不繁殖也不死亡）培养基包括脱纤维羊血、兔血或马血，20%脱脂牛乳，7.5%葡萄糖的马血清。将待保存菌株（培养24~48小时）加入上述培养基中，封好瓶口，置-70C液氮或-70C低温冰箱中保存。菌种不同造成保存时间差异，最长可保存10年，最短可保存2年以上。冷冻真空干燥法冷冻真空干燥法的培养基（保存剂）有两种，一种是用10%~20%脱脂牛奶加入0.1%的谷氨酸钠和0.03%的L-半胱氨酸，煮沸15分钟消毒，冷却备用。另一种是用10%蔗糖与马血清的混合液，过滤灭菌，并置厌氧环境中预还原，分装备用。将培养48小时左右（处于生长静止期）的厌氧菌落或菌苔刮下，加入一定量的上述培养基，混匀分装于安瓿中，置20°C低温冰箱中迅速冻结，再放入冷冻干燥机内，抽真空16~24小时，然后将安瓿封口，置4C环境下长期保存。结核分枝杆菌保存法短期保存方法（悬浮液低温保存法）结核分枝杆菌充分悬浮于经高压灭菌的20%丙三醇-生理盐水中，保藏在-20C。使用该方法，大部分分枝杆菌能保存1年以上。长期保存方法（悬浮液超低保存法）10mg结核分枝杆菌充分悬浮于冻存溶液（6g胰蛋白胨溶于100ml20%丙三醇水溶液）中，保藏温度-70C。使用该方法，大部分分枝杆菌能保存5年以上。真菌菌种保存法冰冻保存法冰冻保存有助于抑制真菌，尤其是抑制皮肤癣菌发生多形性变化，即变异（当其培养物变成白色蓬松绒毛状时，真菌就失去所有特征性的颜色及形态学特征，甚至会停止产生各种孢子，由此会导致菌种鉴定困难）。真菌接种在沙氏培养基上培养8~10日或直至见到菌落将近要全面覆盖培养基时，将试管置于-20C冰箱中保存。4.4.2石蜡油保存法真菌接种于沙氏琼脂上，25C培养，酵母菌2~4日，产孢子的丝状真菌需形成成熟的孢子，不产孢子的真菌生长成健壮的菌丝为止。覆盖2cm的无菌石蜡（矿物）油（石蜡油的灭菌一般在1小时以上，然后将自然冷却的石蜡油加入含真菌的试管中，使液面高于斜面顶部1cm左右）。使用此方法，许多真菌可在室温下存活数年。在恢复培养时，先从石蜡油下面挑取一小块（2~3mms）菌落，沿试管壁边挑取边挤压过多的石蜡油（因石蜡油过多会抑制真菌生长），然后接种于沙氏琼脂斜面上，培养数日并观察生长情况。水保存法将