荧光定量PCR技术原理及应用

荧光定量PCR技术原理及应用

REAL-TIMEPCR高冬妮PCR产物的积累是按照2n指数扩增。PCR后借助电泳对扩增反应的终产物进行定量及定性分析。常规PCR的局限性：◆只能对终产物进行分析，无法对起始模板准确定量；◆必需借助电泳方法分析，费时费事而且EB有毒；◆无法对扩增反应实时检测。RT-PCR荧光探针杂交技术PCR技术荧光定量PCR荧光WhatisReal-TimePCR?

荧光实时定量PCR技术的产生

1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB加入PCR反应体系，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度。核酸↔荧光染料后来用与双链DNA有更强结合力的SYBRGreenI

取代EB.WhatisReal-TimePCR?WhatisReal-TimePCR?所谓实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量和定性分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，产物不断积累，荧光信号强度也等比增加。通过检测荧光强度的变化，我们就可以得到荧光扩增曲线。①样品处理③琼脂糖电泳③PCR反应中实时检测④EB染色④自动数据分析②荧光染料②常规PCR⑤⑥人工数据分析荧光定量PCR与普通PCR的比较●实时荧光定量PCR三个关键词：

实时荧光定量●如何实时检测借助荧光物质示踪扩增产物量的变化。随着PCR反应的进行，扩增产物不断积累，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图。扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度扩增曲线分成三个阶段：背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。定量PCR扩增曲线概念Baseline是背景曲线的一段，范围——从反应开始不久荧光值开始变得稳定，直到所有反应管的荧光都将要，但是还未，超出背景。Threshold荧光超过本底，达到可检测水平时的临界数值CTthresholdcycle，临界循环数(荧光信号达到阈值所经过的循环数）。threshold横线与扩增曲线相交，所得交点所对应的循环数。

阈值，荧光强度标准如何对起始模板定量?

通过CT值和标准曲线实现对起始模板的定量分析。为什么要用CT值定量？在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该CT值具有极好的重复性。线性关系根据样品CT值，就可以计算出样品中所含的模板量CTLogofDNAconcentration绝对定量用于生成标准曲线的样品如何设定？含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的cDNA紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度根据质粒或cDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀释病毒感染的定量监测

HIV感染后，潜伏期长短和临床症状轻重与血液中的病毒量显著相关。病毒载量是预测HIV异性恋间传播风险的主要因素，在HIVRNA水平小于1500个拷贝/mL时的传播很少发生。因此，采用荧光定量PCR的方法检出HIVRNA对临床有重要的意义。绝对定量分析实时定量PCR检测HIV绝对定量肿瘤耐药基因表达的研究

real-timePCR是了解肿瘤耐药，指导临床治疗策略的有用手段，它能观测用药前后肿瘤细胞的耐药基因mRNA表达变化，从而及时调整治疗方案和评价疾病的预后。

相对定量分析内参基因的选择

特点选择内参基因内参基因beta-actin、GAPDH、18SrRNA、28SrRNA等--文献检索--实验筛选选择多个备选内参基因，以备选内参基因的几何平均数作为均一化标准

内参基因HousekeepingGene--RNA抽提、反转录为cDNA的效率不同，用于定量分析的样本初始浓度不同。对样本初始浓度差异进行均一化校正。不同环境，不同器官、组织、细胞类型之间，表达量相对恒定。2-ΔΔCt法满足条件：1）内参基因和目标基因的扩增效率接近-正负10%2）内参基因和目标基因的扩增效率基本为90%-110%

相对定量数据分析1、目标基因的CT值-内参基因的CT值（ΔCT

）2、待测样本的ΔCT值-对照样本的ΔCT值（ΔΔCT

）3、计算表达水平比率：2–ΔΔCT=表达量的变化倍数2-△△Ct

法

目的基因内参基因目的基因-内参基因△Ct待测样本-对照样本△△Ct倍数值fold2-△△Ct

对照样本30.48523.6256.8601待测样本27.02522.664.365-2.4955.63728双标准曲线法（1）不同基因扩增效率存在差异，用标准曲线来校正扩增效率。（2）比较适合于样本量不大，但研究的基因较多的客户。（3）双标准曲线：内参基因、目标基因

校正模板核酸数量上的差异Real-timePCR检测原理◆荧光标记扩增产物，动态监测荧光信号变化非特异性荧光标记：

SYBRGreenI特异性荧光标记：水解探针：

TaqMan非水解探针：Molecularbeacon（分子信标）

RQReporterQuencherRQ

染料法与探针法对比探针法特异性高--探针与特异靶序列结合对模板有选择性--可进行多重PCR反应成本高--不同靶基因需要合成不同探针

染料法通用性好--对DNA模板没有选择性使用方便，成本低--仅需设计两个引物有假阳性现象--通过融解曲线判断5’3’5’3’SGSGSGSG5’3’5’3’SGSGSGSGEmissionExcitationSYBRGreenI是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料。SYBRGreenI只与双链DNA结合才能发出荧光。荧光信号的强度与反应体系中所有双链DNA分子成正比。

SYBRGreenI工作原理熔解曲线PCR中，可控制温度缓慢升高(ie.60octo95oc,0.2oc/sec)双链DNA解链成为单链DNASYBRGreenI被释放，荧光信号消失以荧光信号强度对温度作图，即为熔解曲线对熔解曲线求一阶导数，峰值代表TmTm值：50%DNA变成单链时的温度，此温度与双链DNA的长度、GC含量有关，可部分代表序列的特异性。融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确非特异性产物非特异性产物进行熔解曲线分析，以判断退火温度是否合适，产物中是否有引物二聚体的影响。对于SYBRGreenI，一定要在最后做一步熔解曲线的分析，这对于反应条件的优化和结果的正确判定都有着非常重要的作用。RealtimePCR流程样本处理与RNA提取–cDNA–realtimePCR样本处理与RNA提取外界刺激

–检测目的基因的表达改变样品处理–固定、裂解细胞RNA样本保存液Trizol

超纯RNA提取试剂盒RNA的评价与鉴定

-完整性

-纯度小心DNA污染！-使用DNaseⅠ-引物设计

-以RNA作PCR阴性对照

RT-qPCR一步法还是两步法？两步法：步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留，检测多个基因，便于反应条件的优化。

推荐：工作的初期阶段，以及单个样本多个靶基因检测。一步法：简单、灵敏度高，有效减少实验操作误差和污染。每次只能做一个基因。

推荐：工作的成熟阶段，以及多个样本单个靶基因检测。逆转录逆转录引物选择逆转录酶SuperRT

逆转录酶（RNaseH-）M-MLV逆转录酶（RNaseH-）引物特异性反应效率Oligo

dT中低Randomhexmer低中Specificprimer高高引物设计原则

上下游引物间Tm值差小于4℃

避免引物错误引发（特别是3’端与靶基因不配对）

避免引物内和引物间的互补（避免形成发夹结构和引物二聚体）跨一个或多个内含子设计引物（避免对基因组DNA的扩增）使用Blast检查引物特异性（/blast)SYBRGreen法

PCR反应的建立SYBRGreen使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测；Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准；MgCl2的浓度：可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物；反应温度和时间参数：由酶和引物决定；其他与常规PCR相同。Troubleshooting

常见问题

可能原因

解决方法Housekeepinggene无信号RNA降解用新鲜组织提取RNAHousekeepinggene有信号而目标基因无信号1.目的基因表达低。逆转录效率不高2.PCR引物不良1.富集mRNA2.在逆转录中尝试不同引物，如特异引物。3.尝试不同PCR引物。减小产物大小，改换目标区段，考虑不同剪接体。4.尝试不同热循程序，降低复性温度。Housekeepinggene反应效率正常,但目标基因放大效率不高PCR引物不良重新设计引物，减小产物大小，改换目标区段，考虑不同剪接体目标基因表达丰度在样本之间异常一致RNA被基因组DNA污染使用跨intron

引物用DNase处理RNA确保RNA阴性对照表现阴性溶解曲线出现杂峰出现非特异PCR产物出现引物二聚体尝试不