基因工程与基因组学

2023/1/231第九章基因工程和基因组学

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§1．基因工程(Geneengineering)一、基因工程概述

1、基因工程的概念20世纪70年代随着DNA重组技术的发展在遗传学上产生了一门新的分支遗传工程（Geneticsengineering）遗传工程:又称遗传操作（Geneticmanipulation）,是以分子遗传学为基础，以现代物理、化学等为手段，按照人们设计的生物蓝图在细胞、染色体和基因等不同水平上，对生物的遗传性状进行定向改造，创造新的生物类型。广义的遗传工程：包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程、基因工程。狭义的遗传工程：即基因工程2023/1/233

2.基因工程的发展：

基因工程的产生和发展在遗传学的发展史上是一次大革命，它打破了种、属的界线，可以在生物大系统内交流基因。其发展情况如下：1971年，史密斯（SmithH.O.）等人从细菌中分离出的一种限制性酶

酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。

1972年伯格（BergP.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和噬菌体DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来得到新的DNA分子。

1982年，美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在细菌中生产人的胰岛素投放市场。自从1983年第一株转基因烟草获得以来，至今已有120种植物转基因获得成功。1996年全球大面积种植，并不断扩大。1996年，克隆羊诞生。2004年3月英国批准大面积种植转基因，但要求非常严格。2005年德国通过法案，严格限制（包括实验室研究）。

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目前世界转基因作物主要为大豆、玉米、棉花和油菜等，以转基因大豆面积最大。

我国是世界上第一个商品化种植转基因作物的国家。到1999年我国已批准中试的转基因作物有48项：包括水稻、小麦、玉米、番茄、白菜、番木瓜、甜瓜、花生、棉花、烟草、广藿香等11种作物；主要目标性状是抗虫、抗病、耐盐、抗冻、耐储藏和抗衰老等。已批准环境释放的有49个品种，涉及水稻、玉米、大豆、马铃薯、番茄、甜椒、线辣椒、棉花、杨树、烟草等10种作物。

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3．基因工程研究内容：

①．从细胞和组织中分离和纯化DNA；②．利用能识别特异性DNA序列的限制性内切酶剪切DNA分子，制备含有目的基因的DNA片段，或采用酶学和化学合成的方法人工合成基因；

③．将DNA片段或人工合成的基因与能够自我复制并具有选择标记的载体在体外连接，形成重组DNA分子；

④．将重组的DNA分子引入受体（宿主）细胞中，使重组DNA分子在受体细胞内复制，产生多个拷贝，即克隆；

⑤．重组DNA能随宿主细胞的分裂而分配到子细胞中，使子代群体细胞均具有重组的DNA分子的拷贝；

⑥．从繁殖的大量细胞群体中筛选和鉴定含有目标基因的重组DNA，受体细胞的克隆；⑦.能从选出的宿主细胞中回收、纯化和分析克隆的重组的DNA分子；⑧.克隆的基因能够正常表达。2023/1/236二、限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶，是一种核酸水解酶，主要从细菌中分离得到，这些酶能识别特定的核苷酸序列，所以称之为限制性内切酶。是基因工程的常用工具酶。⑴．限制性内切酶的命名：

根据其来自的生物名称，用英文字母和数字表示；

①.EcoRI来自大肠杆菌（Escherichiacoli）；

②.HindⅢ来自嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）。2023/1/237⑵．限制性内切酶的类别：

根据限制性内切酶的作用特点，可分为两类：第Ⅰ类酶、第Ⅱ类酶第Ⅰ类酶

：如EcoB(大肠杆菌B株)、EcoK(大肠杆菌K株)分子量较大(约300，000)，由于这类酶的切割部位无特异性，是随机的，每隔一段DNA序列随机切割双链DNA分子，切割点不固定，所以在基因工程中很少应用。

第Ⅱ类酶（）：

如EcoRI(大肠杆菌)、HindⅢ(嗜血杆菌)，分子量较小(约20，000-100，000)，这类酶的切割部位有特异性，可准确切割DNA双链的特异序列，因此在基因工程中广泛应用。

2023/1/238这类酶的切割点是对称序列。如回文对称序列（又称反向重复序列，即从两个方向阅读，其序列相同的序列）。识别特定的碱基序列，交错切割产生二个粘性末端。二个平齐末端。

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

产生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

产生平齐末端2023/1/239三、载体

载体是将“目的”基因即重组DNA分子导入受体细胞的运载工具。

DNA载体：质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体等，现在使用的载体都是采用基因工程的方法构建的。载体的条件：

①.具有复制原点，能自我复制，并能带动携带的外源DNA一起复制。

②.具多克隆位点，即有多种限制酶的切点；且切点不存在于复制原点或抗性选择标记内，即切点不影响复制和标记性状的表现。

③.至少有一个选择标记基因，便于鉴定进入宿主细胞与否，如抗生素基因或某种酶的基因，而宿主细胞没有这些基因。

④.易从宿主细胞中回收克隆。

2023/1/2310一些常用的载体：

㈠、细菌质粒

：质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子，是质粒具有重组表型检测标记，可检测是否携带外源DNA片段。可用于克隆分子量小于10kb(1kb=1000bp)的外源DNA片段。经典的大肠杆菌质粒载体1.pSC101第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。（1）类型天然质粒，属低拷贝型。（2）长度9.09kb（3）选择标记四环素抗性Tetr6个克隆位点：EcoRI、XhoI、PvuI、HindIII、BamHI、SalI主要使用EcoRI。（其中HindIII、BamHI、SalI3个位于选择标记Tetr的内部）（4）克隆位点当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。含有抗菌素的培养基（选择培养基）中能够生长抗菌素抗性基因的受体菌抗菌素选择原理活死抗性基因抗菌素2023/1/2315另：pUC18质粒具有以下特点：

①.分子量小，可接受较大外源片段；

②.拷贝数多，500个／细胞；

③.克隆位点的酶切位点多，克隆方便；

④.具有用于检测重组质粒的选择标记（如α–互补的显色表型）。

③lacZ的肽互补1）-肽（lacZ’

）：-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。lacZ只有在4聚体的状态下才有功能此酶由500kd的四聚体构成

C端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aa4聚体2）受体菌lacZ突变（lacZ∆M15）受体菌基因组的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解X-gal受体菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5apUC质粒载体上的lacZ’

编码肽与这个缺失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体，从而能分解X-gal，产生蓝色物质。C端大部分N端的11-41aapUClacZ’受体菌lacZ∆3）载体lacZ’与互补4）互补的插入失活pUC载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成。不能互补。

lacZ’5’3’肽移码突变lacZ’5’3’肽不互补互补MCS外源DNA④IPTG的诱导作用IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ的C端部分和载体的lacZ’肽都表达。从而互补。但载体MCS上插入外源DNA后，仍然不能产生肽！IPTG通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。MCS无插入时，互补，蓝菌斑。MCS有插入时，不互补，白菌斑。IPTG诱导的结果：2023/1/2323㈤、细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome，BAC)：

BAC载体一般可携带大于50kb的外源DNA片段。F因子改造成BAC载体，甚至可用于克隆100kb以上的DNA片段。㈥、酵母人工染色体(yeastartificialchromosome，YAC)：

YAC具有自主复制序列、克隆位点和可在细菌和酵母菌中选择的标记基因；还具有酵母菌染色体一些特点；

2023/1/2324四、基因的分离与鉴定一般而言，一个基因是编码一条多肽链的一个DNA片段包括启动子、终止子及内含子等。在DNA重组技术出现之前，由于DNA分子量大而结构单一，DNA是细胞中最难分析的大分子。DNA重组技术发展成功之后，DNA已成为细胞中最易操作分析的大分子。DNA的体外重组：1.体外通过限制性内切酶的修剪和DNA连接酶的连接；2.目标DNA分子+载体DNA，共价连接；3.获得重组DNA分子。2023/1/2325㈠、从基因库中分离基因：

1.基因库（genelibrary）：

是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。从基因库中分离基因，首先要构建基因库。

根据克隆核酸序列、来源，基因库可分为：核基因库、染色体库、cDNA库、线粒体库等2023/1/2326①.核基因库：

核基因库(genomiclibrary)：将某生物全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成。

构建文库可采用不同的载体：

质粒载体：重组质粒导入感受态细胞收集菌落。

噬菌体或柯斯质粒(cosmid)载体：将重组DNA包装进噬菌体感染细菌收集噬菌斑。

BAC(细菌人工染色体)或YAC(酵母人工染色体)载体：重组人工染色体导入宿主细胞收集细胞。

②.染色体基因库：

将染色体用来构建基因库,可选择特异基因和分析染色体结构和组织。如果蝇的多线染色体：对染色体进行微切割，可以构建染色体区段的基因文库。③.cDNA库：

以mRNA为模板反转录酶合成互补DNA构建基因库。cDNA库与核DNA库不同：cDNA库仅具有细胞或组织内表达基因的mRNA序列仅包括基因组的部分基因序列。

2023/1/23272.筛选基因库：

根据待选基因相关信息确定筛选方法和条件从基因库中筛选、分离基因。多数方法是利用一段核苷酸序列(DNA、cDNA或寡聚核苷酸)或抗体作探针(Probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针筛选基因库。

筛库过程：

将噬菌体感染形成的噬菌斑印影在硝酸纤维膜上变性带有目的基因的放射性DNA或cDNA作探针进行杂交放射性自显影杂交信号（黑点）对应的噬菌斑即为阳性克隆。2023/1/23283.阳性克隆的分析与鉴定：

从基因库中筛选出阳性克隆，分析、鉴定，得到目的基因。

⑴.限制性酶图谱：

根据同源性分析，了解阳性克隆片段的酶切位点及相对位置用于进一步亚克隆或同已知的其它序列比较。右图为一个15kbDNA片段的限制性酶图谱构建方法。

2023/1/2329⑵.核酸分子杂交：

①.Southern杂交分析：

将琼脂糖中的DNA转移到尼龙膜进行DNA分子杂交分析的方法。②.Northern杂交分析：与Sorthern杂交的原理和程序相同。

用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水平，检测mRNA的存在。③.Western杂交分析：用于蛋白质的分析。

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㈡、PCR扩增基因：

聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)可以体外快速扩增DNA。

美国Mullis(1986)发明(现代生物学发展史上的里程碑)。

PCR反应三个步聚(一个循环)：

1.变性：94－95℃使模板DNA双链变成单链；

2.复性：50－70℃下，引物分别与互补DNA单链互补配对；

3.延伸：在引物的引导和Taq酶作用下，72℃下合成模板DNA的互补链。

PCR反应通常有25－35个循环，一般可扩增5kb左右的片段。㈢、（三）、人工合成基因：根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来，可很快地人工合成基因

2023/1/2331五、基因工程的应用：目前，基因工程研究发展迅速，已取得一系列重大突破。基因工程技术已广泛用于工业、农业、畜牧业、医学、法学等领域，为人类创造了巨大的财富。2023/1/2332㈠、基因工程工业：

最早应用基因工程生产人的蛋白质的方法是在细菌中表达人的胰岛素(1982)。

基因工程生产人的胰岛素的方法如左下图所示。

现已在细菌中生产10多种药品，例如表皮生长因子、人生长激素因子、干扰素、乙型肝炎工程疫苗等。

目前，酵母菌、植物悬浮细胞、植株和动物培养细胞均成功地应用于表达外源蛋白。

2023/1/2333㈡、植物基因工程：

植物基因转化是指将外源基因转移到植物细胞内、并整合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程。

许多植物基因已经被分离、克隆。

农杆菌转化法和基因枪转化法应用最多。

2023/1/2334根癌农杆菌转化技术：

根癌农杆菌介导的植物转化技术应用最早（双子叶植物单子叶植物）。

过程：将目的基因与启动子（花椰菜病毒35S）及终止子组成嵌合DNA分子插入到Ti衍生质粒RB与LB内构成重组质粒，转化农杆菌细胞，利用重组农杆菌去感染植物细胞使质粒部分DNA包括目的基因，整合到植物染色体，实现遗传转化。

利用抗草甘磷(glyphosate)E.coli中分离克隆的EPSP合成酶基因，已培育出高抗除草剂转基因植物。

2023/1/2335第二节．基因组学(Genomics)

基因组学(geno