发酵工程制药工艺技术基础

生物制药工艺学2023/1/222概述微生物菌种的选育与保藏微生物的培养发酵过程的控制第六章微生物制药工艺技术基础L-异亮氨酸生产工艺维生素C生产工艺思考题2023/1/223微生物发酵制药概述发酵工程制药的基本过程2023/1/224

抗生素的发现1928年，英国细菌学家FlemingB发现抗菌物质青霉素。在20世纪40年代，一共发现了14种抗生素，50年代发现了20余种，年代开始了化学结构改造的合成和半合成抗生素阶段。目前发现并分离到约9000种抗生素，半合成抗生素约1000种，共万种以上。但实际生产和应用的只有100余种。微生物发酵制药2023/1/225发酵制药种类

微生物菌体发酵、微生物酶发酵、微生物代谢产物、发酵微生物转化发酵。微生物发酵制药2023/1/226制药微生物的种类

生产药物的天然微生物主要包括细菌、放线菌和丝状真菌三大类。细菌主要生产环状或链状多肽类抗生素，如芽孢杆菌(Bacillus)产生杆菌肽（bacitracin），细菌还可以产生氨基酸和维生素，如黄色短杆菌（Brevibacteriumflarum）产生谷氨酸，大小菌生产维生素C。

放线菌主要产生各类抗生素，以链霉菌属最多。生产的抗生素主要有氨基糖苷类、四环类、放线菌素类、大环内酯类和多烯大环内酯类。

真菌的曲菌属产生桔霉素，青霉素菌属产生青霉素和灰黄霉素等，头孢菌属产生头孢霉素等。微生物发酵制药2023/1/227发酵制药的基本过程

发酵制药就是利用制药微生物，通过发酵培养，在一定条件下，生长繁殖，同时在代谢过程中产生药物，然后，从发酵液中提取分离、纯化精制，获得药品。菌株选育（mutationandselectionbreeding）、发酵(fermentation)和提炼(isolationandpurification)是发酵制药的三个主要工段。工艺过程包括发酵和分离纯化两个阶段。

发酵阶段包括生产菌、孢子制备、种子制备、发酵培养，是生物加工工程过程。

分离纯化阶段包括发酵液处理与过滤、分离提取、精制、成品检验、包装、出厂检验，是化学分离工程过程。

成品检验：包括性状及鉴别试验、安全试验、降压试验、热源试验、无菌试验、酸碱度试验、效价测定、水分测定等。

成品包装：合格成品进行包装，为原料药。制剂由制剂车间或厂再分装。微生物发酵制药2023/1/228新药生产菌的选育自然分离

:样品的采集与处理分离方法有稀释法和滤膜法活性测定非致病菌为对象，采用琼脂扩散法测定活性，筛选生物活性物质。可以使用耐药和超敏菌种。用HPLC、LC－MS等，分析鉴定活性物质。其他现代的筛选技术如靶向筛选、高通量筛选、高内涵筛选等可以结合使用。微生物菌种的选育与保藏2023/1/229新药生产菌的选育

自然选育

:在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，叫自然选育或自然分离。

基本过程如下：

菌种→单孢子或单细胞悬液→适当稀释→琼脂平板分离→挑单个菌落进行生产能力测定→选出优良菌株。

自然选育简单易行，可达到纯化菌种、防止退化、稳定生产水平和提高产量的目的。但效率低，增产幅度不会很大。微生物菌种的选育与保藏2023/1/2210新药生产菌的选育

诱变育种

:诱变育种是人为创造条件，使菌种发生变异，从中筛选优良个体，淘汰劣质个体，是当前菌种选育的一种主要方法。其特点是速度快、收效大、方法相对简单。但缺乏定向性，要配合大规模的筛选工作。

诱发突变的因素有物理、化学和生物三类。

诱变育种方案的设计

诱变育种整个过程涉及诱变和筛选两个阶段，甚至是不断多轮重复。微生物菌种的选育与保藏2023/1/2211新药生产菌的选育

杂交育种:是两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选具有新性状的菌株。带有定向育种的性质。接合、原生质体融合两种方法。基因工程技术育种：采用基因工程技术即基因克隆与表达技术，过量表达或抑制表达某一个或一组基因，调控代谢过程，实现目标产物的高效表达。微生物菌种的选育与保藏2023/1/2212新药生产菌的保藏

目的：保持长期存活、不退化、不丧失生产能力。

保存原理：使其代谢处于不活跃状态，即生长繁殖受抑制的休眠状态，可保持原有特性，延长生命时限。保存方法：斜面低温保存、液体石蜡密封保藏、砂土管保藏、冷冻干燥保藏、液氮低温保藏。微生物菌种的选育与保藏2023/1/2213新药生产菌的保藏保存机构：中国典型培养物保藏中心（武汉大学）中国科学院典型培养物保藏委员会：中国普通微生物菌种保藏管理中心、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC,北京)、抗生素菌种保藏管理中心、中国医学微生物菌种保藏中心。美国典型菌种保藏中心（AmericanTypeCultureCollection）

日本技术评价研究所生物资源中心(NITEBiologicalResourceCenter)英国国家菌种保藏中心(TheUnitedKingdomNationalCultureCollection)微生物菌种的选育与保藏2023/1/2214微生物生长的六大营养要素碳源凡是构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质均称为碳源。包括糖类、醇类、脂肪、有机酸等。微生物的培养氮源凡是构成微生物细胞和代谢产物中氮素的营养物质均称为氮源。可分为有机氮源和无机氮源两类。生长因子指微生物生长不可缺少的微量有机物，包括氨基酸、维生素、核苷酸、脂肪酸等。无机盐和微量元素生理活性物质的组成成分或具有生理调节作用，磷、硫、铁、镁、钙、锰、铜、锌、钴、钾、钠、氯。一般低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用。水和能源2023/1/2215微生物培养基培养基（medium）是人工配制的供微生物生长繁殖和产生各种代谢产物所需要的多种营养基质。微生物的培养种类：按其组成的来源分为合成培养基和天然培养基；按其状态可分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基；按其用途可分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。

影响培养基质量的因素：原料质量、水质、灭菌的影响以及培养基的黏度。2023/1/2216微生物培养基——发酵培养基

配制一般原则

（1）生物学原则：根据不同微生物的营养和反应需求，设计培养基。各种成分之间比例恰当，特别是有机氮和无机氮源，C/N比。一定条件下，各种原材料之间不能产生化学反应。具有适宜的pH和渗透压。

（2）工艺原则：不影响通气和搅拌，又不影响产物的分离精制和废物处理，过程容易控制。

（3）低成本原则：原材料要因地制宜，来源方便，丰富，质量稳定，质优价廉，成本低。

（4）高效经济原则：生产安全，环境保护，高质量，最高得率，最小副产物。微生物的培养2023/1/2217微生物培养基——发酵培养基设计基本思路

（1）根据他人的经验和成分，初步确定培养基的成分，作为研究的起始培养基。

（2）单因素实验，确定最适宜的培养基成分。

（3）多因素实验，进行各成分之间浓度优化和最佳配比。如均匀设计、正交实验和响应面分析等统计学方法。

（4）从摇瓶、小型发酵罐，到中试，最后放大到生产罐。

（5）综合考虑各种因素，产量、纯度、成本等后，确定一个适宜的生产配方。微生物的培养2023/1/2218基本概念杂菌（contaminatedmicrobe）：对于发酵生产过程，除生产菌以外的任何生物微生物。灭菌工艺污染（contamination）：感染杂菌的发酵体系。消毒(disinfection)：指用物理或化学方法杀灭或清除病原微生物（pathogen），达到无害化程度的过程，只能杀死营养体，而不能杀灭芽孢体，杀灭率99.9%以上。杀菌：杀灭或清除病所有微生物的过程，杀灭率99.9999%以上。灭菌（sterilization）：是指用物理或化学方法杀灭或清除物料或设备中所有生命物质的技术或工艺过程，达到无活微生物存在的过程，微生物杀灭率99.999999%以上。2023/1/2219常用灭菌方法与原理

化学灭菌是指用化学物质杀灭生物细胞的灭菌操作。其原理是使蛋白质变性，酶失活，破坏细胞膜透性，细胞死亡。常用化学灭菌剂如高锰酸钾、漂白粉、氯气，有机化合物如70％～75％乙醇、甲醛、戊二醛、环氧乙烷、2％新洁尔灭、3%～5％石炭酸等。主要适合用于皮肤表面、器具、实验室和工厂的无菌区域的台面、地面、墙壁及局部空间或某些器械的消毒。灭菌工艺

辐射灭菌是指利用紫外线、高能量电磁波或粒子辐射灭菌，其中以紫外线最常用。其原理在于核酸和蛋白质在紫外区有强烈的吸收，DNA吸收紫外线后，会形成嘧啶二聚体，如胸腺嘧啶二聚体，分子之间的交联改变了DNA的功能，从而导致生物细胞死亡。只适宜于表面灭菌，常用于一定空间的空气灭菌，如无菌室、超净工作台等的灭菌。2023/1/2220常用灭菌方法与原理

加热灭菌分为蒸汽湿热法和干热法。对于干热灭菌，是实验室常用的器皿的方法。工业采用160℃、2h，或170℃、1h干热空气，用于需保持干燥的器械、容器的灭菌。温度越高，时间相应缩短。湿热灭菌效果优于干热灭菌，常用条件为115℃～121℃，压力1×105Pa，维持15～30分钟。芽孢是一种休眠体，外面有厚膜包裹，耐热性很强，不易杀灭。因此在设计灭菌操作时，经常以杀死芽孢的温度和时间为指标。为了确保彻底灭菌，实际操作中往往增加50％的保险系数。灭菌工艺2023/1/2221发酵过程的主要控制参数与检测

物理参数：温度、压力、搅拌转速、搅拌功率、通气量、黏度、料液流量等。发酵过程的控制温度：保证酶活性的重要条件，不同的微生物菌种的最适生长温度和产物形成的最适温度都是不同的。2023/1/2222发酵过程的主要控制参数与检测发酵过程的控制

化学参数：酸碱度、基质浓度、溶解氧浓度、氧化还原电位、产物浓度等。pH值：对微生物生长的影响很明显；发酵液的pH变化是菌体产酸和产碱的代谢反应的综合结