基因工程载体噬菌体载体XXXX

2012.09第二节噬菌体载体

2噬菌体载体（phagevectors）一、噬菌体载体二、单链噬菌体载体三、噬菌粒载体四、柯斯质粒载体一、噬菌体载体噬菌体是一类细菌病毒（Bacteriophage）（一）噬菌体的一般特性结构：蛋白质外壳内包裹着DNA（双链、单链、线性、环状等）。T4Bacteriophage71.噬菌体的生物学特性溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶源性细菌。在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNA被称为原噬菌体。噬菌体温和噬菌体，具有溶源生长周期和溶菌生长周期烈性噬菌体,只具有溶菌生长周期分为两种：（1）溶菌周期：噬菌体的生活周期烈性噬菌体（virulentphage)（2）溶原周期：感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化温和噬菌体（temperatephage)2、噬菌体的的结构和和其核酸酸类型：结构：无尾部结结构的二二十面体体型、具尾部结结构的二二十面体体型、线状体型型核酸类型型：最常常见的是是双链线线性DNA、双链环形形DNA、单链环形形DNA、单链线形形DNA、单链RNA。3、λ-DNA的物理理图谱λ-DNA为线线状双链链DNA分子，，两端各各有一个个12核核苷酸的的互补单单链（粘粘性末端端）GGGCGGCGACCT,CCCGCCGCTGGA，称称为cos区，，全长48.5kb。。特点是功功能相近近的基因因在基因因组中聚聚集在一一起。λ噬菌体体组成特点点：双链线状状DNA分子，，全长50kb，，含65个个基因，，在其分子子两端各各含有12个碱碱基的互互补单链链，是天天然的粘粘性末端端，被称称为COS位点点。λ噬菌体体感染细细菌后的的溶菌性性生长和和溶源性性生长溶菌性生生长（lyticpathway）噬菌体感感染细菌菌后，借借助其2个COS位点点互补成成环，在在宿主菌菌体内连连续复制制，合成成大量基基因产物物，进而而装配成成噬菌体体颗粒，，裂解宿宿主菌，，释放出出来的噬噬菌体又又可感染染其他细细菌。溶源性生生长(lysogenicpathway)噬菌体感感染细菌菌后，可可将自身身DNA整合到到细菌的的染色体体中去，，与之一一起复制制，并遗遗传给子子代细胞胞，宿主主细胞不不被裂解解。噬菌体AWBDEFZJattxisNclcroOPQSR结构区重组区调控区裂解区cos位位点cos位点ARAREcoRI目的基因因EcoRIEcoRI插入型置换型AWBCDEFZUVGHMLKIJb2cIcrocIIOPQSRattintxisgamredcIIINCOSCOS头部基因因尾尾部基因因功功能不不明区溶源化重重组早早期期控制阻阻遏遏DNA合成溶溶菌生长非必必须区段段cI基因因：溶源源过程控控制基因因。λ噬菌体体的基因因组结构构5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’’3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’’CleavageLigation(duringpackaging)(afterinfection)GGGCGGGCGACCTCG-3’5’-CG+GC-5’’3’-GCCCCGCCGCTGGAThephagecosendsCircularformLinearform（二）λλ噬菌体体载体的的主要类类型（1）插入式载载体一种只具具有一个个可供外外源DNA插入入的克隆隆位点的的派派生载载体。（2）替替换型型载体（（取代型型载体））具有成对对的克隆隆位点，，在这两两个位位点之间间的λDNA区段可可以被外外源插入入的DNA片段段所取代代。（3）凯凯伦伦噬菌体体载体（2）λλ替换换型载体体（取代代型载体体）外源DNA取代代噬菌体体染色体体中对于于噬菌体体的感染染和复制制非必要要的片段段(~20kb)高感染效效率(109转化株/ug载载体DNA,比比质粒高高100-倍)e.g.EMBL3,DASH替换式载载体野生型噬噬菌体染染色体的的中段对对于噬菌菌体的感感染和复复制是非非必要的的，外源源DNA可以取取代这一一片段，，例如Charon4A、、λEMBL3/4、、Charon40等等载体，，这些载载体是用用Lac5（（乳糖操操纵子的的大部分分系列，，包括完完整的LacZ）替替换入噬噬菌体的的中间区区段，同同时将Lac5作为为选择标标记，使使用时用用EcoRI水水解，去去掉中间间的片段段，再与与欲克隆隆片段在在体外进进行重组组、包装装。而后后，感染染E.coli使之在E.coli内繁殖，，并裂解解E.coli，形成空空斑。换型噬菌菌体λ是是使用最最广泛的的载体。。（3）凯凯伦噬菌菌体载体体既有插入入型；又又有替换换型在基因工工程实验验中的用用途十分分广泛承受外源源DNA的能力力：几个个kb到到23kb（左右臂臂连接））（（三段段自身连连接）（（插入片片段）（三）体体外包装装λ噬菌体体DNA体外重重组后，，一般必必须经过过体外包包装，然然后以噬噬菌体感感染的方方式将重重组DNA导入入E.coli细胞内。。这是因因为以感感染方式式导入细细胞的频频率可达达106~108/μgDNA，，而以转转染（translation）的的方式导导入的频频率仅为为103~105/μgDNA。λ噬菌体体的包装装限制为为野生噬噬菌体DNA（（约48.5kb））的75%~105%。由于λ噬菌体包装时，当DNA的长度短于野生型的78%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降。因此只包装它的野生型DNA（48.5KB）的75%~105%左右的ＤＮＡ，要求λ载体DNA和外源DNA长度之和在39～53kb之间。插入式载体可携带的外源ＤＮＡ片段较替换式为小。

◆λ噬噬菌体载载体可接接受15kb-23kb的外源源DNA片段，，它既可可作为克克隆载体体，也可可作为表表达载体体，广泛泛用于各各类基因因库的构构建。筛选标记记：蓝白斑(LacZ)、噬菌斑等。重组噬菌菌体的分子量量必须在在野生型噬噬菌体分子量大大小的75%至105%之间。用途：b.用于构建建基因组组或cDNA文文库。c.用于抗抗体库库或随随机肽肽库的的构建建。a.用作一一般的的克隆隆载体体。（四））λλ-DNA的抽抽提大肠杆杆菌培培养至至对数数生长长期2)加加入入λ-噬菌菌体或或重组组λ-噬菌菌体悬悬浮液液，37℃℃培养养1hr3)用用新新鲜培培养稀稀释，，继续续培养养4-12hr4)高速离离心，沉淀噬噬菌体5)苯酚抽抽提，释放λλ-DNA6)乙醇或或异丙醇沉淀淀DNA（五）λ-DNA作为载载体的优点体外包装病毒毒颗粒，高效效感染E.coli2)装载外外源能力为25kb，大大于质粒3)筛选方方便4)重组λλ-DNA分分子提取容易易二、、单链链噬噬菌菌体体载载体体（一一））单链链噬噬菌菌体体载载体体M13、f1、fd噬菌菌体体单链链环环状状DNA的丝丝状状大大肠肠杆杆菌菌噬噬菌菌体体：：M13噬菌菌体体单链链DNA噬噬菌菌体体载载体体M13、、f1、、fd。。优越越性性：：1.单单链链DNA噬噬菌菌体体的的复复制制，，是是以以双双链链环环形形的的DNA为为媒媒介介的的，，这这种种复复制制形形式式的的DNA简简称称RFDNA；；2.不不论论是是RFDNA还还是是ssDNA都都能能感感染染大大肠肠杆杆菌菌；；3.单单链链DNA噬噬菌菌体体颗颗粒粒的的大大小小，，是是受受其其DNA的的多多制制约约的的，，不不存存在在包包装装限限制制问问题题；；4.容容易易测测定定外外源源DNA片片断断的的插插入入取取向向；；5.可可产产生生含含外外源源片片断断的的单单链链DNA分分子子。。3.M13噬噬菌菌体体噬菌菌体体正链链复制制复制制型型DNA经pII蛋蛋白白造缺缺口口3′′5′′经pII蛋白白剪切切释出出单单链链DNA(正链链)进入入下下一循循环环5′′3′′3′′5′′滚环环复复制制在细细菌菌内内的的复复制制模模式式图图M13噬噬菌菌体体几几个个重重要要特特点点：1.M13噬噬菌菌体体不溶溶解解宿主细胞胞，只是是降低宿主细胞胞的生长长速度。。2.M13噬菌体体能以单链和双链两种方式式存在，，因此可可以用感染(经包装装的单链链DNA)和转化(双链DNA)。3.克克隆的外外源基因因片段不不宜大于于1000bp。M13噬噬菌体载载体M13是一一种含单单键（+）DNA（ssDNA）的的丝状大大肠杆菌菌噬菌体体，其基基因组大大小为6.4kb。这这类载体体主要用用来获得得大量的的单链ＤＤＮＡ片片段，这这种单链链ＤＮＡＡ片段在在遗传学学研究中中主要用用来测定定ＤＮＡＡ序列（（sanger双脱氧氧法）、、基因的的定点突突变研究究、异源源双链DNA的的分析等等。M13噬噬菌菌体体的的特特点点感染染Ecoli后，，在在宿宿主主细细胞胞内内会会形形成成双双链链的的复复制制型型ＤＤＮＮＡＡ（（replicationformDNA,RFDNA））。。可可以以象象质质粒粒ＤＤＮＮＡＡ那那样样在在体体外外进进行行纯纯化化和和操操作作。。成熟熟的的噬噬菌菌体体颗颗粒粒仅仅能能感感染染E.coli的F+细胞胞，，这这是是因因为为这这种种噬噬菌菌体体的的感感染染位位点点在在性性散散毛毛上上。。但但是是无无论论是是RFDNA或或ssDNA都都能能转转染染E.coli的F+或F-细胞胞。。噬菌菌体体颗颗粒粒的的大大小小是是受受其其ＤＤＮＮＡＡ的的大大小小制制约约的的，，这这一一点点正正好好与与λλ噬噬菌菌体体相相反反。。所所以以M13噬噬菌菌体体并并不不存存在在包包装装限限制制的的问问题题。。M13单单链链DNA噬噬菌菌体体的的生生命命周周期期RFDNAPhageM13replicationinthehostcell:+RNApolDNApolIII±RFNickedbygene2protein+ss-Rollingcirclereplication,thencutandligateCoatedwithgene5proteinGene5proteinisreplacedbygene8proteinect.LinearM13phagereleasedfromthecell.（二）M13载体体的构建（1）克隆隆区域的选选定①基因间间隔区（intergenicregion,IG区））J.Messing证明，，IG区存存在M13的复制起点，但可以插插入外源DNA而不不影响M13噬菌体体的活力。。在IG区内内插入一个个大肠杆菌菌的LacZ’’（-肽序列)。利用-肽序列中中的三个单单一酶切位位点（BglII、AvaII和和PvuI））。(2)加入入酶切位点点①在IG区内加入入单一内切切酶位点第一个M13载体：：M13mp1：M13RFBsuI不完全消化化各种长度的的线性片断断（其中应有有只在IG上切开的的线性全长长M13））E.colilac基因的HindII片断(lacI、lacP、lacO、lacZ’’）连接M13mp1JM101宿主只有在IG区插入lacZ’’才能存活并并在Xgal上出现互补补的蓝噬菌菌斑（三）M13系列列载体的优优点1）有MCS，，便于克隆隆不同的酶酶切片段2）Xgal显色反反应，可供供直接选择择3）无包装装限制，克克隆能力大大4）可以克克隆双链DNA分子子中的每一一条链子代M13噬菌体中中包含的是是单链+DNA。（四）M13噬菌体体用途：1）DNA序列列测定；2）制制备单链DNA探针针；3）用用于定点突突变的研究究。M13载体体具有多克隆隆位点(MCS)，，方便克隆隆。许多M13载体体的多克隆隆位点与质质粒载体pUC序列列的多克隆隆位点是相相同的，在在克隆位点点选择上更更为方便。。可以定向地地克隆DNA片段，，克隆在M13RFDNA分子上上的双链DNA片段段，到了子子代噬菌体体便成了单单链的形式式。所以如如果要同时时分离ＤＮＮＡ分子中中的双链，，则需要两两种独立的的克隆。根根据M13的生物学学特性知道道，M13子代噬菌菌体中总是是只含有（（＋）链，，所以M13载体克克隆的外源源DNA片片段在子代代噬菌体中中究竟是含含有DNA分子中的的哪条链，，则完全取取决于外源源ＤＮＡ克克隆时的取取向。这样样一来，为为分别分离离外源ＤＮＮＡ分子的的两条链带带来一定的的麻烦，解解决这一问问题的一个个行之有效效的方法就就是定向克克隆技术。。M13克隆载载体分子结构构图三、噬菌粒载载体噬菌粒载体由质粒载体和和单链噬菌体体载体结合而而成的新型的的载体系列。。它具有质粒的的复制起点、、选择性标记记、多克隆位位点等，方便便DNA的操操作，可在细细胞内稳定存存在；又具有有单链噬菌体体的复制起点点，在辅助噬噬菌体的存在在下，可进行行噬菌体的繁繁殖，产生单单链的子代噬噬菌体。噬菌粒载载体（phagemidvectors）由质粒载体体与单链噬菌菌体载体体的复制起起点结合合而成的的新型载载体系列列。MCS噬菌体ori质粒oriAmprlacZ’lacI约3000bp（比M13小小）②克隆能能力大能插入10kb的外源源DNA。③两种复复制形式式①分子量量小1、噬菌菌粒载体体的特点点既具有质质粒的复复制起点点，又具具有噬菌菌体的复复制起点点。既能在大大肠杆菌菌中以质质粒的形形式双链链复制，，又能在在噬菌体体内进行行单链复复制。常用的噬噬菌粒载载体pUC118和pUC1191.具具有较小小分子量量的共价价、闭合合、环形形的基因因组DNA，可可克隆10kb的外源源DNA片段，，并易于于进行分分离与操操作；2.编编码一个个ampr基因作为为选择记记号，因因此只有有携带pUC118或或pUC119噬菌粒粒载体的的大肠杆杆菌转化化子细胞胞，才能能够在含含有氨苄苄青霉素素的培养养基中生生长，便便于转化化子的选选择；3.拷拷贝数含含量高，，每个寄寄主可高高达500个，，所以只只要用少少量的大大肠杆菌菌细胞培培养物，，便可制制备出大大量的载载体DNA；4.存存在着一一个多克克隆位点点区，因因此许多多种不同同类型的的外源DNA片片段，不不经修饰饰便可直直接插入入到载体体分子上上；5.由由于多克克隆位点点区阻断断了大肠肠杆菌lacZ基因的的5’-端编码码区，可可按照IPTG组织化化学显色色反应试试验，筛筛选重组组子；6.lacZ基因是是置于lac启启动子的的控制之之下，这这样插入入的外源源基因便便会以融融合蛋白白质的形形式表达达；7.含含有质粒粒的复制制起点，，在没有有辅助噬噬菌体的的情况下下，克隆隆的外源源基因可可以像质质粒一样样按常规规的方式式，复制制形成大大量的双双链DNA分子子8.带带有一个个M13噬菌体体的复制制起点，，在有辅辅助噬菌菌体感染染的寄主主细胞中中，可以以合成出出单DNA拷贝贝，并包包装成噬噬菌体颗颗分泌到到培养基基中；9.在在pUC118和pUC119这两两个载体体中，多多克隆位位点区的的核苷酸酸序列取取向是彼彼此相反反的，于于是它们们当中的的一个可可转录克克隆基因因的正链链DNA，另一一个则可可转录出出负链DNA；；10.可可以直直接对克克隆的DNA片片断进行行核苷酸酸的序列列测定，，免去了了从质粒粒载体到到噬菌体体的这一一烦琐的的亚克隆隆步骤。。pBluescript噬菌菌粒载体基本结构：：1.在多多克隆位点点的两侧，，有一对T3和T7噬菌体的的启动子，，可以定向向指导外源源基因的转转录活动；；2.同同时具有一一个单链噬噬菌体M13或f1的复制起起点和一个个来自ColE1质质粒的复制制起点，在在不同的情情况下，可可以采取不不同的复制制形式，分分别合成单单链或双链链的DNA；3.编编码有一个个胺苄青霉霉素抗性基基因，供作作转化子记记号；4.含有lacZ基基因，可用用Xgal-IPTG组织显显色反应法法筛选噬菌菌粒载体。。T7T3用于体外转转录3PCR产物物克隆载体体T载体体pCR系列列载体Invitrogen公司开开发的线性噬菌粒载体体。①结构pUC的质质粒部分、、fi噬菌菌体ori、Kanr和Ampr抗性。MCS的中中部已经切切开，各有有一个3’’端突出的的T。②特点PCR产物物往往在3’端突出出一个A，，所以能与与这个载体体直接连接接。Tvector的克隆过程程——简便！AATTTvectorPCRproductT4DNAligaseAA四、柯斯质质粒载体柯斯质粒(cosmid)一种人工构构建的克隆隆载体，包包含了λ噬噬菌体的cos基因因。柯斯质质粒能被包包装到λ噬噬菌体粒子子中，感染染大肠杆菌菌；它携带带入宿主细细菌的DNA片段（（超过45kb）要要比质粒载载体携带的的要大（一）粘粒粒(cosmid)组成：2.抗抗性基因；；1.质质粒复制的的起始位点点(ORI)；3.用用于插入目目的基因的的单个酶切切位点；4.噬菌体的cos位点点。可见，cosmid是由质粒和和噬菌体的cos位点点构建而成。。与噬菌体载载体和质粒粒载体相比比具有多个个优点：（1）具有有cos位位点，能高高效地转化化大肠杆菌菌，能在大大肠杆菌中中实现自身身环化，并并能在大肠肠杆菌中复复制；（2）有像像质粒一样样的选择标标记；（3）cosmid载体比较较小，但能能插入较大大的外源片片段，可克克隆外源片片段的长度度在15~45kb之间。。由于cosmid载载体的大片片段克隆能能力，多用用于基因组组文库的构构建，而λλ噬菌体载载体多用于于cDNA文库的构构建。已有有多种粘粒粒载体可用用于基因克克隆，pJB8是最最常用的粘粘粒载体之之一（4)多多种单一酶酶切位点，，便于克隆隆1、粘粒载载体的优点点柯斯质粒载载体的特点点具有λ噬菌菌体的特性性；具有质粒载载体的特性性；具有较高容容量的克隆隆能力；具有与同源源性序列的的质粒进行行重组的能能力特点：可插入长达达27～41kb的外源基因因，方便地地用于克隆大片段段DNA。加入噬菌体头部和尾部部蛋白，可可将粘粒包装成成类似于噬菌体的具感染能能力的颗粒粒，方便地地进入大肠肠杆菌。粘粒进入细细菌后则完完全失去噬菌体的功能能，而而表现现质粒的特性性。柯斯质质粒载载体cosmid载载体：也称称粘粒粒、柯柯斯载载体。。这是是一类类用于于克隆隆大片片段DNA的载载体，，它是是由λλ噬菌菌体的的cos（（cohesive）末末端及及质粒粒（plasmid）重重组而而成的的载体体。cosmid载载体带带有质质粒的的复制制起点点、克克隆位位点、、选择择性标标记以以及λλ噬菌菌体用用于包包装的的cos末末端等等，因因此该该载