基因工程的基本操作程序二

复习回顾1、基因工程又称为？2、基因工程中用到的工具中，“分子手术刀”是？来源是？其作用是？体现了酶的什么特性？作用部位是什么键？3、限制酶切割之后的结果是产生？从中轴线两侧切割得到的是什么末端？从中轴线处切开呢？4、获得目的基因需要切几个切口？产生几个黏性末端？5、“分子缝合针”是？根据什么分为两大类？哪两大类？这两类酶的区别是？6、载体主要有哪几类？最常用的是？它的本质是？载体必须具备的四个条件是？大肠杆菌(EcoRI)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。写出切开后产生的粘性末端。基因工程的基本操作程序原核细胞的基因结构(补充内容）非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子①不编码蛋白质。：编码蛋白质,连续不间断编码区非编码区原核细胞的基因结构②调控遗传信息表达,上

游有启动子，下游有终止子真核细胞的基因结构（补充内容）编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子非编码序列：包括非编码区和内含子基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。一、目的基因的获取目的基因供体生物细胞取出DNA限制酶剪去多余部分限制酶1.目的基因主要是指______________________编码蛋白质的结构基因2、获取目的基因的常用方法（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成1.概念：基因文库（genelibrary）基因组文库部分基因文库（如cDNA文库）

将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(genelibrary)基因组文库:

基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.部分基因文库:

基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.基因因组组文文库库与与部部分分基基因因文文库库的的关关系系3.如何何从从基基因因文文库库中中得得到到所所需需要要的的基基因因？？依据据：：目目的的基基因因的的有有关关信信息息。。如：：根根据据基因因的的核核苷苷酸酸序序列列基因因的的功功能能基基因因在在染染色色体体上上的的位位基因的转录产物mRNA基因的翻译产物蛋白质等特性。4.为为什什么么要要构构建建基基因因文文库库？？直直接接从从含含有有目目的的基基因因的的生生物物体体内内提提取取不不行行吗吗？？构建建基基因因文文库库是是获获取取目目的的基基因因的的方方法法之之一一，，并并不不是是唯唯一一的的方方式式。。如如果果所所需需要要的的目目的的基基因因序序列列已已知知，，就就可可以以通通过过PCR方式式从从含含有有该该基基因因的的生生物物的的DNA中，，直直接接获获得得，，也也可可以以通通过过反反转转录录，，用用PCR方式式从从mRNA中获获得得，，不不一一定定要要构构建建基基因因文文库库。。但如如果果所需需要要的的目目的的基基因因的的序序列列完完全全不不知知，或或只知知道道目目的的基基因因序序列列的的一一段段，或或想从从一一种种生生物物体体内内获获得得许许多多基基因因，或或者者想知知道道这这种种生生物物与与另另一一种种生生物物之之间间有有多多少少基基因因不不同同，或或者者想知知道道一一种种生生物物在在个个体体发发育育的的不不同同阶阶段段表表达达的的基基因因有有什什么么不不同同，或或者者想得得到到一一种种生生物物的的全全基基因因组组序序列列，往往往往就就需需要要构构建建基基因因文文库库。。2.利利用用PCR技技术术扩扩增增目目的PCR———多多聚聚酶酶链链式式反反应应是一项生生物体外复制制特定DNA片段的核核酸合成成技术。。通过此此技术，，可获取取大量的的目的基基因。PCR技术原理：前提：原料能量方式PCR扩增仪DNA复制一段已知知目的基基因的核核苷酸序序列：以_____方式扩增增，即____（n为扩增循循环的次次数）指数2n模板DNA；DNA引物；四种脱氧氧核苷酸酸；热稳定DNA聚合酶（（Taq酶）；过程变性、退退火、延延伸三步步曲变性：加热至90～95℃双链DNA解链链成为单单链DNA退火：冷却至55～60℃引物与部分模板的单单链DNA的特特定互补补部位相相配对和和结合延伸：加热至70～75℃以目的基基因为模模板，合合成互补补的新DNA链链变性退火延伸3.人人工合成成——根据已知知的氨基基酸序列列合成DNA蛋白质的的氨基酸酸序列mRNA的核苷酸酸序列结构基因因的核苷苷酸序列列推测推测目的基因因化学合成成二.基因因表达载载体的构构建——核心质粒DNA分子一个切口两个黏性末端端两个切口获得目的的基因DNA连接酶重组DNA分子（重重组质粒粒）同一种限限制酶酶目的基因因与运载载体的结结合过程程，实际际上是不不同来源源的基因因重组的的过程。。目的：组成：1、使目的的基因在在受体细胞胞中稳定存存在，且且可以遗遗传给下下一代，，2、使目的的基因能能够表达和发挥作用用。它们各自自的作用用是什么么?目的基因因+启动子+终止子+标记基因因+复制原点点启动子：：位于基因因的首端端的一段段特殊的的DNA片断，它它是RNA聚合酶识识别和结结合的部部位，有有了它才才能驱动基因因转录出出mRNA，最终获获得蛋白白质终止子：：位于基因因的尾端端的一段段特殊的的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因因的作用是是为了鉴别受体细胞胞中是否否含有目目的基因因，从而而将有目目的基因因的细胞胞筛选出出来复习回顾顾1、基因工工程的基基本操作作程序的的四个步步骤是？？核心是是？2、目的基基因指的的是什么么基因？？3、获取目目的基因因常用的的三种方方法是？？其中人人工合成成法又包包括哪两两种?4、基因文文库包括括哪两类类？它们们有什么么区别？？5、PCR的原理是是？PCR扩增过程程中的解解旋方式式是？PCR需要的条条件有？？7、基因表表达载体体的构建建的目的的是？8、一个基基因表达达载体的的组成包包括哪几几部分？？9、标记基基因的作作用是？？10、启动子子，终止止子的位位置，作作用？起起始密码码子，终终止密码码子呢？？三、将目目的基因因导入受受体细胞胞（一）转转化：（二）方方法将目的基基因导入入植物细胞胞将目的基基因导入入动物细胞胞将目的基基因导入入微生物细细胞农杆菌转转化法（双、裸裸）基因枪法法（单）花粉管通通道法——显微注射射技术——用钙离子子处理细细胞得到感受态细细胞目的基因因进入_________内，并且且在受受体细细胞内维维持_____和_____的过程受体细胞胞稳定表达1、将目的的基因导导入植物物细胞的的方法：：（1）农杆菌转转化法①农杆菌特特点：易感染双双子叶植植物和裸裸子植物物，对大大多数单单子叶植植物没有有感染能能力②原理：Ti质粒上的的T-DNA可以转移移到受体体细胞，，并整合合到受体体细胞染色体的的DNA上。③过程：（2）基因枪法法（3）花粉管通通道法2、将目的的基因导导入动物物细胞①方法：显显微注射射法②程序：目的基因因表达载载体提纯纯取取卵卵（受精精卵）显显微注射射受受精精卵新新性性状动物物3、将目的的基因导导入微生生物细胞胞①原核生物物特点：：繁殖快快、单细细胞、遗遗传物质质少②方法：用Ca2+处理细胞胞感受态细细胞表达载体体与感受受态细胞胞混合感感受受态细胞胞吸收DNA分子（二）方方法将目的基基因导入入植物细细胞将目的的基因因导入入动物细细胞将目的的基因因导入入微生物物细胞胞农杆菌菌转化化法（双、、裸））基因枪枪法（（单）花粉管管通道道法——显微注注射技技术——用钙离离子处处理细细胞得到感受态态细胞胞四、目目的基基因的的检测测与鉴鉴定——检查是是否成成功（一））、检检测1、检测测转基基因生生物染染色体体的DNA上是否插插入了了目的的基因因(关键步步骤)①首先先取出出转基基因生生物的的基因因组DNA②用含目的基基因的的DNA片片段用放射射性同同位素素等作作标记记,以以此做做探针③使探针针和转转基因因生物物的基基因组组杂交交,若若显示示出杂杂交带带,表表明基基因已已插入入染色色体DNA中（1）方法:DNA分子杂杂交（2知识延延伸——DNA分子杂杂交技技术该方法法是根根据碱碱基互互补配配对原原则，，把互互补的的双链链DNA解开，，把单单股的的DNA小片段段用同同位素素、荧荧光分分子或或化学学发光光催化化剂等等进行行标记记，之之后同同被检检测的的DNA中的同同源归纳步步骤（二））、鉴鉴定（（个体体生物物学水水平））2、检测测目的的基因因是否转转录出出了mRNA3、检测测目的的基因因是否翻翻译成成蛋白白质抗虫鉴鉴定、、抗病病鉴定定、活活性鉴鉴定等等①方法:方法:抗原-抗体杂杂交②过程:用上述述探针针和转转基因因生物物的mRNA杂交,若出现现杂交交带,表明目目的基基因转转录出出了mRNA归纳步骤骤(四)目的基因因的检测测与鉴定定——检查是否