第九章发酵工程下游技术发展及发酵液的预处理

第九章发酵工程下游技术发展及发酵液的预处理下游技术（工程）：对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。概述下游加工过程的重要性。（组成、费用和关注程度）1.组成：下游加工过程是生物技术的重要组成部分，发酵液或反应液需要经过下游加工过程才能成为成品；2.费用：传统发酵工业中下游部分的费用占整个工厂投资费用的60％，而对重组DNA生产蛋白质等基因工程产品，下游加工的费用可占整个生产费用的80％－90％；3.关注程度：英国政府工业部于1983年发起生物分离计划（BIOSEP），专门研究下游加工过程；1987年英国化学工业会召开了专门讨论下游加工过程的国际会议；我国也于1989年在济南召开了一次专门会议；近十年来国内外有关生物分离或蛋白质纯化的专著陆续出版。第一节发酵工程下游技术发展一、发酵产物的分类

从工业发酵范畴来看，从发酵液中获得的发酵产物大致可分为三类：1、菌体：2、酶：3、代谢产物二、下游加工技术的特点1.发酵液的复杂性造成分离上的困难性。粗原料中带入大量的不参与发酵过程的可溶性杂质和不溶性悬浮物，给下游过程的分离提取带来了不小的困难，增加了下游操作成本，包括发酵废液的处理成本

2.欲提取的产物通常浓度低且很不稳定。

一些新兴生物技术产品，待处理物料中产品浓度很低，往往低于杂质含量，如L—异亮氨酸为2.4％，青霉素为3.6％，每千克产品中核黄素仅含几克、胰岛素仅含几十毫克，而且对热、PH、有些甚至对光不稳定。

生物活性物质的活性还易受温度、pH、金属离子、无机盐浓度、有机溶媒等环境因素的影响。制约了下游技术的可选范围。3.多为分批操作，各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一定弹性。四、生物工业下游技术的发展历程2.纯培养阶段古代酿造业包括酿酒、制酱（油）、醋、酸奶和干酪等。技术原始、家庭式作坊、产物基本不经过后处理而直接使用，无下游技术。主要指1860－1930。发现了发酵的本质是微生物的作用，掌握了纯种培养技术，生物技术进入近代酿造产业的发展阶段。逐渐开发形成了发酵法生产酒精、丙酮、丁醇等微生物发酵工业（厌氧发酵），其产品相对简单，基本上是无活性的小分子。此时开始引入过滤、蒸馏、精馏等近代分离技术。1.古代酿造业以20世纪40年代出现的青霉素产品为代表。无菌空气制备技术、大型好氧发酵装置开发，一大批通风发酵技术产品相继投入了工业生产，如抗生素（链霉素）、氨基酸（谷氨酸）、有机酸（核酸、柠檬酸）、酶制剂（淀粉酶）、微生物多糖和单细胞蛋白等。产品多样性决定了分离方法的多样性。借鉴和引进吸收了大量的近代化学工业的分离技术，如沉淀、离子交换、萃取、结晶等。3.液体深层发酵阶段以20世纪70年代末崛起的DNA重组技术及细胞融合技术为代表。生物技术在其主要领域：基因工程、酶工程、细胞工程和发酵工程取得了长足进步，一批高附加值的产品开始面世，如乙肝疫苗、干扰素、功能因子、低聚糖、活性肽、高度不饱和脂肪酸等。生物技术在深度和广度上都取得了很大的进展。很多企业开始加强在生物工业下游技术领域的研究开发力量，不断推出新技术、新产品、新装备，以抢占更多的市场。新技术有超临界CO2萃取技术、膜过滤、渗透蒸发技术、各种色谱（层析）技术等。4.现代生物技术阶段20世纪80年代以来，生物工业下游技术进步很快，出现了很多新概念、新技术、新产品和新装备。大致可分为以下几大类：（1）固液分离技术絮凝技术引入到发酵液的预处理上，研究开发了菌体及悬浮物絮凝技术，改善了发酵液的分离性能，加之纤维素助滤剂的开发，大大提高了发酵液的固液分离效率。在固液分离机械方面，也出现了一些性能优良的新型机械，如带式过滤机、板框过滤机、螺旋沉降式离心机等。微滤膜可高效分离细微的悬浮粒子。已开发出珠磨破碎、高压匀浆法、X-press法和化学破碎等技术。该技术的成熟使得胞内代谢产物的大规模工业化生产成为可能。（2）细胞破碎技术主要开发了沉淀、离子交换、萃取、超滤等技术。较早出现的是酶及蛋白质的盐析法；有机溶剂沉淀法；双水相萃取技术比较适合于胞内活性物质和细胞碎片的分离；超滤技术解决了生物大分子对pH、热、有机溶剂、金属离子敏感等难题，在生物大分子的分级、浓缩、脱盐等操作中得到了广泛的使用。（3）初步分离纯化技术小分子物质一一般可通过离子交换、脱色和结晶、重结晶等方法获得纯纯度很高的产产品。生物大大分子的纯化化一直是个难难题。20世纪70年代以来，逐逐渐开发出各种色谱（层层析）技术，如亲和色谱谱、疏水色谱谱、聚焦色谱谱、离子交换换色谱和凝胶色谱等，后两种技技术已开始用用于批量生产产。（4）高度分离纯纯化技术（5）其他新型分分离技术超临界CO2萃取技术在获得天然生生物物质方面面有着独特的的优势。20世纪80年代以来，已已经在许多领领域中迅速实实现了工业化化。如啤酒花花中有效成分分和咖啡豆中中咖啡因的萃萃取分离。介介于反渗透和和超滤之间的的纳米滤技术，由于其能使使水和大部分分无机盐通过过而截留分子子量300-1000的小分子有机机物，且操作作压力低，在在生物工业和和水处理中具具有广阔的应应用前景。渗透蒸发技术术、液膜技术术及反胶团技技术的研究和应用用开发等也相相继取得了很很大的进展。。五、发酵工业业下游技术的的一般工艺过过程下游加工过程程由各种化工单单元操作组成成。由于生物产产品品种多，，性质各异，，故用到的单单元操作很多多，其中如蒸馏、萃取、、结晶、吸附附、蒸发和干干燥等属传统的单单元操作，理理论比较成熟熟，而另一些些则为新近发发展起来的单单元操作，如如细胞破碎、膜膜分离和色层层分离等，缺乏完整整的理论，介介于两者之间间的有离子交换过程程等。1.一般工艺过程程一般说来，下下游加工过程程可分为4个阶段：（1）预处理和固固液分离：目的是除去发发酵液中的菌菌体细胞和不不溶性固体杂杂质（离心和过滤）。（2）初步分离：目的是除去与与产物性质差差异较大的杂杂质，为后道道精制工序创创造有利条件件（萃取、吸附、、沉淀、蒸发发）（3）高度纯化：去除与产物的的物理化学性性质比较接近近的杂质（层析、膜分离离、离子交换换、沉淀、电电泳）。（4）产品的最后后加工：成品形式由产产品的最终用用途决定（结晶、干燥、、蒸馏）。下游加工一般般工艺流程发酵液菌体提取、分离纯化、精制产物胞外产物胞内产物离心或过滤细胞破碎离心或过滤离心或过滤干燥含产物的清液液离心或过滤干燥产物固体部分下游工艺过程程决定于产品品的性质和要要求达到的纯纯度如产品为菌体体本身，则工工艺比较简单单，只需经过过滤、得到菌菌体，再经干干燥就可，如如单细胞蛋白白的生产。如可以从发酵酵液直接提取取，则可省去去固液分离步步骤。如为胞外产物物则可省去细细胞破碎步骤骤。2.如何着手对一一种未知的发发酵产品进行行提取。（1）产品的类型型，性质的研研究。大致确定它是是属于哪一类类型；了解它是一种种成分还是几几种成分的混混合物。（2）稳定性研究究。确定在哪一种种条件下进行行提取和精制制不受破坏，，即确定提取条件件。适合于大规模模工业化生产产的传统技术术经过改造提提高后，适应应面更宽，效效率会更高，，仍然显示出出强劲的生命命力。各种新型高效效的过滤机械械和离心机械械的问世，结结晶理论和离离子交换技术术的新进展，，提高了产品品的收率、质质量和生产效效率。六、生物工业业下游技术的的发展动态——成本、质量、、环保将是该技术发发展方向和动动力1.传统分离技术术的提高和完完善2.新技术的研究究开发膜（膜材料和膜膜制造工艺））、树脂（离子交换树树脂和大网格格树脂）和凝胶（琼脂糖凝胶胶为基质，与与各种配基结结合后制成各各种色谱分离离介质）是目目前主要的新新型分离介质质。各种分离纯化化技术相互结结合、交叉、、渗透，形成成子代分离技技术。如膜技术和萃萃取、蒸馏、、蒸发技术相相结合形成了了膜萃取技术术、膜蒸馏及及渗透蒸发技技术；色谱技技术与离子交交换技术等结结合形成了离离子交换色谱谱、等电聚焦焦色谱等。（1）新型分离介介质的研究开开发（2）子代代分离离技术术（3）其他他新兴兴下游游技术术由溶剂剂萃取取技术术衍生生出一一大批批生物物工业业分离离技术术，如如双水水相萃萃取、、超临界界CO2萃取、反胶团团萃取取（细胞胞碎片片去除除、细细胞胞胞内物物质、、酶及及蛋白白质、、天然然生物物物质质的提提取分分离））；菌体絮絮凝技技术和菌体细细胞破破碎技技术的进展展为工工业化化经济济的分分离菌菌体细细胞和和大规规模生生产胞胞内物物质创创造了了技术术前提提。第二节节发发酵酵液的的预处处理一、发发酵液液的一一般特特征1.含水量量高，一般般可达达90％-99%2.产品浓浓度低低3.悬浮物物颗粒粒小，密度度与液液体相相差不不大4.固体粒粒子可可压缩缩性大大5.液体黏黏度大大6.产物性性质不不稳定定二、发发酵液液预处处理的的目的的和要要求1.预处理理的目目的：：（1）改变发发酵液液的物物理性性质，促进进悬浮浮液中中分离离固形形物的的速度度，提提高固固液分分离的的效率率（2）尽可能能使产产物转转入便便于后后处理理的某某一相相中（多数数是液液体））（3）去除发发酵液液中部部分杂杂质，以利利于后后续各各步操操作。。2.发酵液液预处处理的的要求求:（1）菌体的的分离离（2）固体悬悬浮物物的去去除（3）蛋白质质的去去除（4）重金属属离子子的去去除（5）色素、、热原原质、、毒性性物质质等有有机杂杂质的的去除除（6）改变发发酵液液的性性质（7）调节适适宜pH值和温温度三、预预处理理的方方法（一））加热热法（二））调节节悬浮浮液的的pH（三））发酵酵液的的凝聚聚和絮絮凝（四））高价价无机机离子子的去去除方方法（五））杂蛋蛋白质质的去去除（一））加热热法：：降低悬悬浮液液的黏黏度，，除去去某些些杂蛋蛋白，，降低低悬浮浮物的的最终终体积积，破破坏凝凝胶状状结构构、增增加滤滤饼的的空隙隙度。。（不不适用用热敏敏性的的物质质）（二））调节节悬浮浮液的的pH通过调节发发酵液液pH到蛋白白质的的等电电点使使蛋白白质沉沉淀，同时络络合重重金属属离子子；常用的的酸化化剂有有草酸、、盐酸酸、硫硫酸和和磷酸酸（三））发酵酵液的的凝聚聚和絮絮凝机理电解质质将胶胶体粒粒子表表面上上的电电荷中中和，，减少少存在在于胶胶体粒粒子间间的静静电斥斥力，，使范范德华华力占占优势势，这这样胶胶体就就会凝凝聚成成较大大、较较密实实的粒粒子（（凝聚），或或在某某些高高分子子絮凝凝剂存存在下下，基基于架桥作作用，使胶胶粒形形成粗粗大的的絮凝凝团使使之更更容易易过滤滤（絮凝）。常用的的凝聚聚方法法在稀溶溶液中中加入入电解解质以以促进进凝聚聚。试试剂包包括酸酸、碱碱、简简单电电解质质和合合成的的高分分子电电解质质。常用的的絮凝凝剂聚丙烯烯酰胺胺、聚聚乙烯烯亚胺胺、聚聚胺衍衍生物物、氯氯化钙钙、磷磷酸氢氢二钠钠影响絮絮凝的的因素素絮凝剂剂的添添加量量发酵液液的pH絮凝剂剂的分分子量量搅拌转转速搅拌时时间絮凝剂剂添加加量对对絮凝凝效果果(滤速)的影响响料液中中，絮凝剂剂浓度度增加加有助助于架架桥充充分，但是是过多多的加加量反反而会会引起起吸附附饱和和，在在每个个胶粒粒上形形成覆覆盖层层而使发酵液液pH对絮凝凝效果果的影影响溶液pH的变化化常会会影响响离子子型絮絮凝剂剂中官官能团团的电电离度度，从从而影影响分分子链链的伸伸展形形态。。电离度度增大大，由于于链节节上相相邻离离子基基团间间的电电排斥斥作用用，而而使分分子链链从卷卷曲状状态变变为伸伸展状状态，，所以以架桥能能力提提高。絮凝技技术预预处理理发酵酵液的的优点不仅在在于过滤速速度的的提高高，还在在于能能有效效地去除杂杂蛋白白质和和固体体杂质质，如菌菌体、、细胞胞和细细胞碎碎片等等，提提高了了滤液液质量量（四））高价价无机机离子子的去去除方方法钙离子子，可用用草酸酸。镁离子子，可用用三聚聚磷酸酸钠它它和镁镁离子子形成成可溶溶性络络合物物，用用磷酸酸盐处处理，，也能能大大大降低低钙离离子和和镁离离子的的浓度度。此此法可可用于于环丝丝氨酸酸的提提取。。铁离子子，可加加入黄黄血盐盐，使使形成成普鲁鲁士蓝蓝沉淀淀。（五））杂蛋蛋白质质的去去除方方法热变性性沉淀大幅度度改变变pH四、发发酵液液的过过滤微生物物发酵酵液中中含有有大量量菌体体、细细胞或或细胞胞碎片片以及及残余余的固固体培培养基基成分分。过滤就就是将将悬浮浮在发发酵液液中的的固体体颗粒粒与液液体进进行分分离的的过程程。在过滤滤操作作中，，要求求滤速速快，，滤液液澄清清并且且有高高的收收率。。（一））影响响过滤滤速度度的因因素过滤速速度和和以下下因素素有关关菌种。。发酵条条件。。培养基基的组组成未用完完培养养基的的数量量消泡剂剂发酵周周期菌种对对过滤滤速度度影响响真菌的菌丝丝比较较粗大大，如如青霉霉菌的的菌丝丝直径径可达达10μμm，发酵液液容易易过滤滤，不需需特殊殊处理理。其其滤渣渣呈紧紧密饼饼状物物，很很容易易从滤滤布上上刮下下来，，故可可采用用鼓式式真空空过滤滤机过过滤。。放线菌菌发酵液液菌丝丝细而而分枝枝，交交织成成网络络状。。如链链霉素素发酵酵液菌菌丝仅仅0.5~1.0μm左右，，还含含有很很多多多糖类类物质质，粘粘性强强，过滤较较困难难，一般需需经预预处理理，以以凝固固蛋白白质等等胶体体。细菌发酵液液的菌菌体更更细小小，因因此，，过滤十十分因因准，如不不用絮絮凝等等方法法预处处理发发酵液液，往往往难难以采采用常常规过过滤的的设备备来完完成过过滤操操作。。发酵条条件对对过滤滤速度度影响响用黄豆豆粉、、花生生粉作作氮源源、淀淀粉作作碳源源会使使过滤滤困难难；发酵后后期加加消泡剂剂或剩余余大量末末用完完的培培养基基也会使使过滤滤困难难。发酵周周期对对过滤滤的影影响正确选择择发酵终终了时间间对过滤滤影响很很大。在菌体丝丝自溶前前必须放放罐，因因为细胞胞自溶后后的分分解产物物一般很很难过滤滤。有时延延长发酵酵周期虽虽能使发发酵单位位有所提提高，但但严重影影响发酵酵液质量量，使色色素和胶胶状杂质质增多、、过滤困困难，最最终造成成成品质质量降低低。（二）改改善过滤滤性能的的方法等电点蛋白质变变性吸附凝聚和絮絮凝加入助滤滤剂直接在发发酵液中中形成填填充-凝固剂酶解作用用助滤剂助滤剂是是一种不不可压缩缩的多孔孔微粒，，它能使使滤饼疏疏松，滤滤速增大大。能形成一一层不可可压缩的的滤层，，截留了了悬浮杂杂质，隔离了细细小、易易压缩杂杂质与过过滤介质质接触，，以形成成疏松滤滤饼。常用的助助滤剂硅藻土、珍珠岩岩、磨碎碎的木浆浆、淀粉粉助滤剂的的加入有有两种方法法：在滤布上上预先铺铺一层助助滤剂(1~2mm)，该方法法，会使使滤速降降低，但但滤液透透明度高高直接加入入发酵液液中。助滤剂种种类、用用量要恰恰当，是取得得良好过过滤效果果的关键键。助滤剂的的用量，，有一条条经验规规则可供供参考，，即助滤滤剂用量量若等于于悬浮液液中固体体含量时时，滤速速最快。。填充-凝固剂改善过滤滤性能较较好的方方法是加加入一些些反应剂剂，它们们能相互互作用，，或和某某些溶解解性盐类类发生反反应生成成不溶解解的沉淀淀(CaSO4，AlPO4等)。生成的沉沉淀能防防止菌丝丝体粘结结，沉淀淀本身即即可作为为助滤剂剂，并且且还能使使胶状物物和悬浮浮物凝固固，如新生霉素素发酵液中中加入氯氯化钙和和磷酸钠钠，生成成的磷酸钙可作为填填充-凝固剂。。一方面面作为助助滤剂，，另一方方面还可可使某些些蛋白质质凝固。。又如环丝氨酸酸发酵液用用氧化钙钙和磷酸酸处理，，生成的的磷酸钙沉淀，能能使悬浮浮物凝固固。多余余的磷酸酸根离子子，还能能除去钙