薄板层析法鉴定四环素纯

会计学1薄板层析法鉴定四环素纯生物分离工程实验I基础实验：第11/12周薄板层析法鉴定四环素成品纯度第14周PEG400/(NH4)2SO4两水相系统相图的制作第15周两水相系统中蛋白质分配系数的测定第16周离子交换树脂总交换容量的测定第1页/共23页实验内容及时间薄板层析法鉴定四环素纯度

实验一班：第11周周一，周四实验二班：第12周周一，周四两水相萃取相图制作

实验一班：第14周周一

实验二班：第14周周四两水相萃取蛋白质分配系数测定

实验一班：第15周周一

实验二班：第15周周四离子交换树脂总交换容量的测定

实验一班：第16周周一

实验二班：第16周周四第2页/共23页实验时间安排表周次日期星期时间发酵实验5-212分离实验5-112115月6日星期一13:30

实验一班5月9日星期四13:30

实验一班125月13日星期一13:30

实验二班5月16日星期四13:30

实验二班135月20日星期一13:30实验二班

5月23日星期四13:30实验一班

145月27日星期一13:30实验二班实验一班5月30日星期四13:30实验一班实验二班156月3日星期一13:30实验二班实验一班6月6日星期四13:30实验一班实验二班166月8日星期六13:30实验二班实验一班6月13日星期四13:30实验一班实验二班176月17日星期一13:30实验二班

6月20日星期四13:30实验一班

第3页/共23页考核方式考勤提问和操作实验报告：预习报告

实验结果、讨论、思考题第4页/共23页薄板层析法鉴定四环素纯度第5页/共23页加深对薄板层析法基本原理的理解。熟悉薄板层析法的操作过程。采用薄板层析法来考察四环素制品纯度。一、目的和要求第6页/共23页（一）层析：色谱chromatography一种分离技术。任何层析都具有两个相，固定相固定不动，流动相对固定相作相对运动。不同物质在两相间分配差异，随流动相以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。固定相：固体或液体(固定在载体上)流动相：流过固定相的液体、气体或超临界流体。二、实验原理第7页/共23页（二）层析方法：根据机理可以分为：分配层析吸附层析凝胶层析离子交换层析亲和层析二、实验原理根据层析的方式：纸层析薄层层析柱层析第8页/共23页（三）薄板层析（TLC）利用不同溶质组分在固定相和流动相的两种液体中分配系数不同，展层时形成以不同速度移动的区带，达到分离。溶质易分配在固定相中溶质易分配在流动相中二、实验原理移动速度慢。移动速度快。第9页/共23页利用阻滞因子Rf值来表征各组分的差别移动：0<Rf<1,适宜范围0.2~0.8二、实验原理溶质移动距离

同一时间流动相移动距离Rf=第10页/共23页二、实验原理固定相：一般为水及各种水溶液、甲酰胺、低级醇等。流动相（展层剂）：与水不溶（或微溶）的有机溶剂。

薄板层析法：支持物:中性、多孔粉末、无吸附活性、流动相自由通过——硅藻土/纤维素/硅胶/氧化铝等，亲水物质能储留水。本实验为硅藻土。本实验为吸附在硅藻土上的EDTA缓冲液。本实验为丙酮:乙酸乙酯:氯仿=3:1:1第11页/共23页（四）四环素广谱抗生素四环素发酵或保管不当时，生成抗菌作用弱，毒性强的差向四环素。四环素易溶于流动相液体，差向四环素易溶于固定相液体。氢化骈四苯环（含共轭双键，可紫外吸收，荧光）

二、实验原理第12页/共23页本实验所需仪器玻璃板研钵天平移液管硅藻土EDTA缓冲液饱和氯化铵缸+架子展层剂展层缸点样毛细管小刀和直尺紫外灯氨水三、主要实验器材与试剂第13页/共23页（一）溶液配制（已配置）硅藻土处理：取薄板层析用硅藻土50g，加25ml浓盐酸和250ml水，搅拌煮沸10min，冷却，过滤，用蒸馏水洗，直至洗液对刚果红指示剂不显颜色，然后用流动相液体洗涤，过滤，105℃烘箱干燥。EDTA缓冲液（固定相）：在40ml甘油中，加入10ml聚乙二醇400，摇匀即得20%（V/V）聚乙二醇400的甘油溶液（保湿），再加入950mlpH70.1MEDTA（鳌合）溶液，混匀即得EDTA缓冲液。展层剂（流动相）：取pH7EDTA溶液5ml，缓慢加在200ml（丙酮:氯仿:乙酸乙酯=3:1:1）溶液中，然后倒入展层缸中。样品配制：称取100mg成品四环素，溶于5ml甲醇中得2%（W/V）溶液。四、实验方法第14页/共23页硅藻土

1g研钵EDTA缓冲液2ml蒸馏水0.75ml研匀（颗粒适中、无气泡）置饱和NH4Cl缸室温放置无明显水渍厚度涂均匀，特别下边缘涂满平整（二）层析操作四、实验方法第15页/共23页第16页/共23页0.5cm15cm1.5cm均匀无气泡无裂纹毛细管点样点样点甲醇挥发干后，将板放入展层缸内，密封晾干，氨气熏，紫外灯下观察分别求两种组分的Rf值量距离展层剂0.5cm样点高于液面

溶质移动距离

同一时间流动相移动距离Rf=第17页/共23页第18页/共23页操作注意点

制板：在研钵中研磨时应缓慢，注意不能产生气泡。薄板移入饱和氯化铵的缸中时，不宜太干或太湿，以无明显水渍为宜。太干展层太快，引起拖尾；太湿展层太慢。点样：点样时，尽量使点样斑点直径小。点样后，待溶剂挥发后再移入展层缸内，不要用电吹风。展层：注意展层剂浸没薄层的一端约0.5cm，不能浸没样品斑点。层析缸盖子应盖密，减少溶剂挥发。第19页/共23页实验结果和讨论（一）预习四环素的硅藻土薄板层析属于哪一种层析机制。固定相和流动相分别是什么？为了使层析效果好（不拖尾，分离好），操作中注意事项。（二）实验结果和讨论在纸上描绘出薄板上斑点的图形，量出各斑点组分的距离，计算Rf值。分析实验结果。总结本实验成功或失败的经验教训。五、思考题第2