薄层色谱及其在药物分析的应用

会计学1薄层色谱及其在药物分析的应用1薄层色谱（Thinlinerchromatography,TLC）概况1.1薄层色谱分类1.1.1按机理分类：吸附薄层，分配薄层，离子交换薄层，凝胶薄层1.1.2按分离效能：经典薄层，高效薄层（HPTLC）第1页/共57页

1.2.薄层色谱的特点

1.2.1.设备简单，操作方便，快速。1.2.2.与纸色谱比较，斑点扩散少，检出灵敏度高10～100倍。1.2.3.可以使用腐蚀性显色剂，如浓硫酸，浓盐酸等。1.2.4.可以同时分析多个样品，无交叉污染。1.2.5.流动相选择范围大。1.2.6.为一次性板，对前处理要求不高。

第2页/共57页薄层色谱与高效液相色谱方法比较（1）比较项目薄层色谱准确性相当相当重复性相当相当灵敏度相当相当特效性相当相当有效分析时间（少）较长较短有效分析时间（多）较短较长流动相流量控制不是关键是关键检测波长下溶剂的影响无大对全部被分离组分的检测方便局限性大吸附剂再生不要求关键第3页/共57页薄层色谱与高效液相色谱方法比较（2）时间有效利用方便方便对污染物抗受力颗粒物质无影响影响大腐蚀性物质无影响影响大不可逆吸附物质无影响有影响自动样品处理可以可以色谱后衍生方便、便宜受限、昂贵操作成本低高在线光谱图记录可以可以进一步发展潜力大较小第4页/共57页2.薄层色谱吸附剂2.1硅胶（Silicage）：具有表面活性，略带酸性。硅胶G,硅胶H,硅胶GF2542.2氧化铝（Aluminumoxide）：具有表面活性，略带碱性（pH8～10）；酸性（pH4）；中性（pH7～7.5）2.3纤维素(Cellulose)：是一种天然多糖类，，主要用于液-液分配薄层色谱担体，其固定液一般就是从环境中吸附的水，通常不需加黏结剂。纤维素匀浆的配制：纤维素与水以1：5～6的比例混合均匀，即可涂布。纤维素薄层干燥后的厚度只有涂布厚度的一半，2.4硅藻土(Diatomaceous)：中性吸附剂，主要用于分配薄层色谱中的担体。主要成分使硅胶。用时需要纯化。2.5葡聚糖凝胶（Sephadex）：铺板：以适量溶剂，如水、二甲亚砜或乙二醇进行溶胀，薄层厚度0.4～1.0mm。配制参数见下表：第5页/共57页葡聚糖凝胶配制参数凝胶型号（粒度25um）凝胶量(g/100ml)最少溶胀时间（h）室温沸水浴SephadexG-5010.531SephadexG-757.5242SephadexG-1006.5723SephadexG-1504.8723SephadexG-2004.5723第6页/共57页2薄层吸附剂2.6聚酰胺：属有机薄层材料，常用的时聚己内酰胺（聚酰胺6）和聚十一酰胺（聚酰胺11）适合分离含酚羟基、羧基、氨基酸等结构和基团的化合物，选择性较高。聚酰胺板制备：16g聚酰胺粉末与65ml蒸馏水，充分振动；或16g聚酰胺粉末与65ml甲醇混匀。薄层板于室温下干燥。第7页/共57页注意：A刚涂布的薄层板不能立即活化。B不是活度越高越好。如硅胶板当含水量为0时，活度太强。反之，当硅胶含水高于17%，氧化铝含水高于6%时，则活性太低，分离效率低。下表是活性级别与含水量的关系。第8页/共57页活性级别与含水量的关系

布罗克曼活性级活性强弱薄层材料含水量（W/W%）硅胶氧化铝1强002533156425105弱3815第9页/共57页吸附剂选择原则6.1.1酸性物质一般用酸性或中性，如硅胶，酸性或中性氧化铝。6.1.2极性大的物质用低活性吸附剂，反之，则用高活性吸附剂。6.1.3常用的吸附剂吸附强弱顺序：硅胶》氧化铝》硅藻土（适合分离极性物质）第10页/共57页3.载板

3.1.载板要求：

化学惰性

一定的强度

表面光滑、平整

厚度均匀

价格便宜

第11页/共57页3.载板3.2.载板种类：玻璃板聚酯箔铝箔3.3.薄层预制板第12页/共57页4薄层色谱点样点样的一般要求：溶剂、点样量、点样器、原点大小

4.1手工点样：定容毛细管（1μl～5μl）CamagCo,DrummondScentifinCo4.2自动点样：手工点样缺点：精度差，时间长，不易操作。喷样仪：Camag公司生产，为条带状喷样系统，基本实现自动化。优点：适合于较大量稀样品溶液的喷加，通过加大点样量降低了检测限。条状色谱图更方便于狭逢式扫描，系统误差小。自动点样仪：Camag生产，是一种适合定量分析的全自动点样仪，液既可以点点状斑点，也可以点条状斑点。第13页/共57页5薄层色谱的展开5.1多次展开：目的是增加有效分离距离。经多次展开后的Rf值可由下式计算：Rfn=1-(1-Rf)n5.2分步展开：几种展开剂从低极性到高极性依次展开。5.3连续展开：使流动相沿薄层连续流动。目的是增加有效分离距离。由于没有展开前沿，故需对照物做参照。

5.4二维展开：沿2个垂直的方向分别展开。方法：将被分离的样品点于薄层板的一个角上，展开到一定距离后，将薄层板取出，挥干溶剂，再将薄层板沿原方向垂直方向展开。5.5离心展开：大大提高分离速度，用于制备色谱。5.6梯度洗脱展开和梯度薄层5.7多维展开、加压展开、控温展开第14页/共57页薄层色谱的展开第15页/共57页

6.展开剂选择

关于溶剂系统的选择和分类方法：溶剂强度法、三角优化法、均匀设计等基本原则：相似相溶原则；由简到繁，由单元到多元。6.1展开剂选择要点6.1.1增加溶剂强度，使Rf值增大，但可能降低分离能力，反之亦然。6.1.2若展开剂中较强组分得体积比小于5%或大于50%，选择性是最大的有利于溶质与展开剂组分的选择性相互作用。6.1.3用乙醚或甲醇代替展开剂中的一种较强组分，可由于形成氢键尔改善选择性。6.1.4若出现斑点拖尾，向展开剂中加少量水，或使用脱活薄层，有利于改善分离。第16页/共57页6.展开剂选择

6.2用多元展开剂时注意事项6.2.1多元溶剂系统作展开剂时，若溶剂组分极性相差较大，且极性大的组分所占比例又很小时，易在展开时出现溶剂脱混现象。其原因是吸附剂对溶剂吸附程度不同，对极性组分易吸附。6.2.2当各组分挥发性不同时，且比例相差较大时，在饱和过程中易发生比例变化第17页/共57页6.3边缘效应及其克服方法

6.3.1定义：点于同一薄层板上同一物质的斑点，在色谱展开过程中，靠近薄层板边缘处斑点的Rf值与中心区域斑点的Rf值有所不同。第18页/共57页6.3.2凹形边缘效应：

○○○○○○○·······第19页/共57页6.3.2凹形边缘效应：被吸附剂吸附较弱的弱极性溶剂或沸点较低的溶剂，在薄层边缘易挥发，又因薄层背面蒸汽较稀薄，致使边缘蒸汽向背面流动，而边缘处蒸发掉的溶剂由溶剂贮存器得到补充，边缘与中心相比，有更多展开剂沿边缘移动，推动溶质斑点向更高处前进。第20页/共57页

○○○○○○○········6.3.3凸形边缘效应第21页/共57页6.3.3凸形边缘效应由于边缘处溶剂蒸发后溶剂的补充，不仅来源于贮存器，且从中心向边缘移动，点的移动向边缘偏移（叶脉形斑点也是如此）。第22页/共57页6.3.4辐射状边缘效应：

。。。。。。。

·······第23页/共57页6.3.4辐射状边缘效应：化合物展开时，除向上移动外，尚横向往外移动。化合物越大，往外移动的距离也越大，原点越靠近边缘，往外移动也越明显第24页/共57页6.3.5克服措施：1.用小体积层析槽或进行预饱和或低温下展开。2.在层析槽内壁贴上浸湿展开剂的滤纸条。3.采用小板或高效板。4.更换展开系统。5在展开槽与玻璃盖交接处涂抹凡士林，以保持密封。

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7.薄层色谱的记录7.1描图就是用铅笔将薄层板上的斑点的形状、大小、相对位置记录下来的一种方法，具有方便、快速的特点，缺点是过于简单、抽象，也不够直观和准确。7.2扫描以选择一至三个波长，对展开轨迹从原点开始扫描直至展开前沿，记录扫描曲线。具有快速、准确的特点，但对无紫外吸收或在所选择的波长处无吸收的斑点则无吸收峰。且也不够直观。第26页/共57页7.3薄层照相目前普遍采用，在中、西新药研究中均要求附薄层照片。7.3.1薄层照片的要求：清晰、真实还原色彩、照片大小适宜7.3.2滤色镜的选择原理拍摄照片时，当光源的色温与胶卷的色温匹配时，色彩能得到真实还原，否则就应该选择合适的滤色镜来升高或降低光源的色温使两者匹配。胶卷按色温不同分为日光型和灯光型，宜分别在5400±1200K与3600±700K内使用。常用来升高色温的滤光镜有柯达雷登80系列和82系列，前者升幅较大，后者用来小幅升温。常用来降低色温的滤光镜有柯达雷登85系列和81系列，前者降幅较大，后者降幅小。第27页/共57页薄层色谱照相7.3.3日光下拍摄：一般在室外光线充足的地方，最好配有自动测光仪，距离30～50cm，调准焦距，测光，以快门线启动快门。一般不需滤光镜。7.3.5紫外灯下拍摄：紫外灯下蓝紫色偏重，色温较高，宜用日光型胶片，但光源色温仍偏高，应选用降低色温的滤光镜，如雷登85系列（A、B、C三种类型）。判断方法：照片色彩偏蓝，说明光源色温偏高，照片偏红，则光源色温偏低。

第28页/共57页7.3.6辅助设备近摄镜为使实物在拍出的照片中所占比例适宜，有时用到。UV-镜可以滤除紫外线。快门线可以消除震动，在拍摄紫外照片时可以不必长时间用手按住快门。三脚架保证相机稳定，拍摄的照片大小一致。第29页/共57页7.3.6曝光方法与时间的确定日光照片与正常照相相似。紫外光下拍摄薄层照片应在暗室中进行，可将薄层板置于两盏紫外光灯之间，使薄层板各个部分所照光线均匀，采用自动曝光，曝光时间一般5～30秒。不熟悉拍摄技巧时可采用同一张薄层板分别以10、20、30秒曝光，选最佳者。第30页/共57页8色谱技术样品预处理方法

8.1样品预处理的目的概述8.1.1.使待测物质有效的从样品基质中释放出来。8.1.2.除去杂志，纯化样品。8.13.富集浓缩样品或进行衍生化。色谱分析的试样形式及所用溶剂都应符合一定的要求。TLC的样品常以溶液状态点于薄层板上，应易挥发，通常选用乙醇、甲醇，或两种溶剂与其他溶剂的混合溶剂，在定量研究时一般不用乙醚、正丁醇或氯仿。第31页/共57页8.2物理的分离与浓缩技术8.2.1过滤：商品滤膜孔径在几十微米至0.025微米之间，常用的为0.05和0.2微米两种。各种滤膜对溶剂的适用性见下表。第32页/共57页滤膜对溶剂的适用性

溶剂纤维素膜聚四氟乙烯膜聚酰胺膜乙腈、甲醇、丙醇、四氢呋喃、二氯乙烷、二氯甲烷不适用适用适用氯仿、环乙烷、己烷、庚烷适用适用适用水、盐酸（1mol/L）适用难以通过适用氢氧化钠（5mol/L）不适用难以通过适用第33页/共57页8.2物理的分离与浓缩技术8.2.1超滤：膜材：醋酸纤维素、聚酰胺、聚砜。除去大分子物质，不改变pH值，不稀释试样，适合小样，尤其是对酸碱不稳定的化合物样品。在药物分析中常用于血浆中游离药物的测定。缺点是待测物质可能被结合在滤膜上而影响回收率。也不适合能与蛋白质或大分子结合的药物。第34页/共57页8.2.2沉淀分离法

沉淀法是测定血清、血浆、全血、组织匀浆等生物样本中的药物时经常采用的样品预处理技术，既可以独立使用，也可以与萃取等其他技术配合使用。常用的有：酸沉淀：常用三氯醋酸、高氯酸。其作用是在低于蛋白质等电点的条件下，蛋白质阳离子与沉淀剂阴离子形成难溶性盐而沉淀。浓度一般为5%～20%。注意：不适合酸不稳定成分；当上清液直接进样时（HPLC），应考虑酸对流动相和色谱柱的影响，最好用缓冲溶液作流动相。与水混溶的有机溶剂：常用的是甲醇、乙醇、乙腈和丙酮，沉淀机理是使蛋白质脱水而沉淀。第35页/共57页8.3吸附和吸收分散在液体或蒸汽介质中的溶质可以利用吸附或吸收的方法分离出来。机理：溶质与吸附剂间的范德华力、氢键力的作用。分为物理吸附和化学吸附。蒸馏：在气相色谱中，适合于被测组分为挥发性物质，目的是除去非挥发性成分。如在分析含挥发性成分的中药材或中成药时，常常采用这种方法。第36页/共57页8.4溶剂的挥发与浓缩

对于液体样品或经过处理后得到的液体样品，如果其浓度在检测限以下往往需要对样品溶液进行浓缩处理。其原则是不损失或破坏待分析物质，同时考虑安全性与经济性。8.4.1自然挥散或在氮气流下吹干。为加快挥发速度，有时可以加热。本法适合小体积样品和挥发性溶剂。如固相萃取的溶液。8.4.2减压蒸发。本法具有温度低、速度快的特点，适合热不稳定样品。8.4.3冷冻干燥。适合受热易分解样品。第37页/共57页8.5溶剂萃取从固体基质或溶液中萃取待测组分。是溶剂进入固体基质溶解，通过浸润、溶解、置换、扩散四个过程，使待测成分从固体基质中分散与溶剂中。常用的有加热回流法（索氏提取）和渗漉法、超声波处理法、微波处理法。索氏提取法提取效率高，但不适合热不稳定性成分。超声波处理法对热不稳定性样品较好。以上方法均应进行方法学考察，如提取时间、次数、基质颗粒大小、超声波频率、溶剂、温度、pH值等。第38页/共57页8.5.1液-液萃取是利用待测组分与样品中干扰杂质在互不相溶的两种溶剂中的分配系数不同而实现样品的纯化，提高分析方法的选择性。方法：溶剂选择：常用溶剂有氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚等。第39页/共57页8.5.1.1萃取溶剂选择原则①保证待测组分被充分萃取进溶剂，有具有很好的选择性，是能完全溶解待测组分中药物及其代谢产物的所有溶剂中极性最弱的一种。②应选择低沸点的溶剂，便于浓缩试样。③选用低黏度溶剂，有利于与样品基质的充分接触，提高萃取效率。④萃取溶剂在操作pH下要有足够稳定性。⑤PH的控制：通过调节pH值，使待测组分至少95%以非离子化状态存在。第40页/共57页

离子对萃取与衍生化萃取离子对萃取：对于强极性化合物或两性化合物的萃取，需要用离子对技术使强极性化合物的离子与具有相反电荷的反离子形成离子对，这种离子对很容易被弱极性的有机溶剂萃取。衍生化萃取：对于不溶于有机溶剂的化合物，可以通过衍生化方法在样品基质内将其转化成能溶于有机溶剂的衍生物，然后再进行萃取。第41页/共57页8.5.2固相萃取（solid-phaseextraction,SPE）优点：安全性，可以避免使用毒性较强或易燃的溶剂。无乳化现象，萃取回收率高，重现性好。操作简便，快速，可同时进行批量样品的预处理。由于可选择的固相萃取材料种类很多适用面广

第42页/共57页固相萃取剂种类8.5.2.1吸附剂经典吸附剂：氧化铝，硅胶新型吸附剂：多孔碳，石墨碳8.5.2.2大孔吸附树脂8.5.2.3离子交换树脂：将离子交换树脂引入聚四氟乙烯（PTFE）薄膜，得到离子交换树脂固相萃取剂。8.5.2.4键合硅胶：键合非极性基团：C1、C2、C8、C18、环己烷、苯基等非极性或弱极性基团。键合极性基团：NH2、CN2、OH键合离子性基团：-COOH、-SO3H第43页/共57页3薄层板的活化处理固定相活化温度活化时间硅胶110℃1h纤维素105℃20～30min氧化铝110℃30min硅藻土110℃30min聚酰胺60～80℃30min不同材料的薄层板的活化条件第44页/共57页9定量薄层色谱方法的认证与方法学评价

9.1认证实验的设计9.2主要认证参数9.2.1方法的选择性：是指该方法在待测组分存在的样品介质中含有杂质组分的情况下，定性检测此组分的能力。当待测组分在0.3～0.7时，扫描峰拖尾因子在0.9～1.1之间时，分离度应大于1.0。9.2.2待测组分在分析过程中的稳定性：应注意样品在采样、样品预处理、储存、展开、薄层板上的行为等过程进行研究，应保证样品在此过程中的稳定性。9.2.3线性及其范围：薄层色谱的线性范围应在待测组分检出量的20%～120%。第45页/共57页9.2主要认证参数9.2.4灵敏度：在考察线性范围时，其灵敏度也同时得到验证。9.2.5精密度：检验一系列结果的一致性程度，一般用相对标准偏差（RSD）表示。重现性（）

再现性（）9.2.5.1重复性：是指在相同测定条件下方法的精密度，往往指同一操作者，使用同一仪器设备，同一批号在短时间内测定结果的一致性。薄层色谱的要求小于3.0%。第46页/共57页9.2.5.2回收率实验

一般要求回收率在95%～105%，《5%注意：①在线性范围内②对照品加入量与样品量一般1：1③不能直接加对照品到已处理好的供试品溶液中4.3检出限，可检测限：考查灵敏度4.4稳定性考查：确定合适的测定时间范围第47页/共57页10薄层扫描定量

10.1原理（略）10.2薄层扫描方法：反射式，透射式，荧光式（253.6，313.1，334.2，365.0，404.7，435.8，546.1，578.0）nm10.3薄层扫描方式：直线扫描（规则圆形或条状斑点）锯齿扫描（直径小于3mm的大斑点，不规则）飞点扫描10.