高三一轮复习【高效课堂+备课精研】基因工程的基本操作程序课件

考点二

基因工程的基本操作程序一轮复习

基因工程抗虫棉的培育过程基因工程的基本操作程序目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定非编码区非编码区启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点开始转录编码区（1）原核生物基因终止子：终止转录非编码区

组成：编码区上游与编码区下游

功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达启动子：RNA聚合酶结合位点，转录起始的信号终止子：终止RNA的合成编码区：编码蛋白质的合成一.目的基因的筛选与获取---基因的结构信使RNA加工mRNA前体成熟mRNA不能编码蛋白质的序列=内含子+非编码区序列编码序列=外显子12345非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点外显子内含子12345启动子终止子一.目的基因的筛选与获取---基因的结构（2）真核生物基因转录转录初级RNA成熟mRNA3启动子真核细胞基因编码区中的内含子不编码蛋白质，但表达时是否转录？

剪切、拼接不完全相同原因：基因的选择性表达。同一个体不同体细胞中基因转录的起点是否相同

一、目的基因的获取和筛选1.目的基因概念：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因；如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关基因。主要是编码特定蛋白质的基因1.从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。如：Bt基因的筛选苏云金杆菌制成杀虫剂掌握目的基因的功能掌握目的基因的结构防治棉花害虫发现杀虫作用与Bt基因有关掌握Bt基因的序列深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白)Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。2.目的基因获取方法从基因文库中获取通过DNA合成仪直接合成利用PCR获取和扩增目的基因基因组文库部分基因文库（主要是cDNA文库）基因文库：从基因文库中直接获取：基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。部分基因文库：含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。与载体连接导入受体菌群用适当限制酶切割（1）基因组文库的构建提取某生物全部DNA许多DNA片段该生物基因组文库（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文库的构建——mRNA逆转录形成mRNA（某一发育时期）逆转录酶杂交双链核酸酶H单链DNADNA聚合酶双链cDNA(cDNA)与载体连接导入受体菌群该生物cDNA文库基因组文库中的基因含有启动子、终止子、内含子。cDNA文库中的基因不含以上结构人工合成：DNA合成仪（1）前提：（2）方法：基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因提取苏云金芽孢杆菌抗虫基因？快速获得大量抗虫基因利用PCR获取和扩增目的基因：PCR——聚合酶链式反应PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，通过在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。体内DNA复制要点回顾:条件原料：游离的脱氧核苷酸（A、T、G、C）模板：DNA的两条链酶：解旋酶、DNA聚合酶等能量：ATP复制原则:碱基互补配对原则（保证复制的准确进行）结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？利用PCR获取和扩增目的基因：PCR扩增仪知道目的基因的两端核苷酸序列，基因又比较大前提：CGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATACGTATACGGCTAGCCGTA3'5'CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ATP解旋酶（1）解旋CGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATACGTATACGGCTAGCCGTA3'5'CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ATP解旋酶（1）解旋CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTT（2）合成子链CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTTACGCAAGCTAGTCATTADNA聚合酶5'3'TATGCATGATCGAGCTT5'3'ATPATPDNA聚合酶形成磷酸二酯键子链延伸合成的方向？只能从5′－端→3′－端延伸CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATAA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTT5'3'TAGCCGTATAGCCGATAT3'5'TTACGCGTATATATA5'3'（3）重新螺旋形成新的DNA分子耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物（2种）稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）四种脱氧核苷酸(dNTP)激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶1.体外PCR的条件：dATPdGTPdCTPdTTP3′5′子链的延伸方向是5′→3′DNA聚合酶3′5′模板链子链因为DNA聚合酶不能直接将单个的核苷酸聚合成链DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端子链合成需要引物引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。a.什么是引物1.体外PCR的条件：

在DNA复制时，DNA聚合酶不能直接从模板链的一端直接开始台成子链，必须由引物提供3’端之后才能开始连接脱氧核苷酸。3’3’3’3’5’5’5’5’3’3’5’5’5’5’3’3’DNA解链为单链高温(95℃)变性低温(50℃)复性中温(72℃)延伸引物结合到互补DNA链Taq酶从引物起始进行子链的合成PCR过程可以在PCR扩增仪(PCR仪)中自动完成。2.PCR扩增目的基因的过程：第1步：变性当温度超过90℃时，双链DNA解旋为单链。2.PCR扩增目的基因的过程：5’3’3’5’5’3’3’5’955072℃预变性90℃以上增加大分子模板DNA彻底变性的概率长度相同但C-G含量高的引物需要设定的复性温度较高。当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。5’3’3’5’第2步：复性5’3’3’5’当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。5’3’3’5’5’3’3’5’3’5’5’3’第3步：延伸第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。5’3’3’5’3’5’5’3’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’第二轮循环的产物作为第三轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环产物。5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’每次循环后目的基因的量可以增加一倍，即形成指数式扩增(2n)。利用PCR获取和扩增目的基因用于PCR扩增的DNA片段往往为了保证目的基因的完整，经切割后目的基因的两端会有一小段非基因序列，其也可能随目的基因一起扩增。PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？AACGGCTTAATT第一次循环90℃以上，DNA双链解开50℃左右，引物与DNA结合72℃左右，新DNA合成3’5’5’3’5’5’3’5’5’5’第二次循环5’3’5’5’3’5’高温变性、低温复性中温延伸第二次循环3’5’高温变性、低温复性第三次循环3’5’中温延伸第三次循环3’5’PCR扩增过程中产生等长的目的基因片段的分析（1）含目的基因的DNA分子在PCR仪中经过1次循环后产生等长的目的基因片段有

个；（2）含目的基因的DNA分子在PCR仪中经过2次循环后产生等长的目的基因片段有

个；（3）含目的基因的DNA分子在PCR仪中经过3次循环后产生等长的目的基因片段有

个；（4）含目的基因的DNA分子在PCR仪中经过4次循环后产生等长的目的基因片段有

个；（5）含目的基因的DNA分子在PCR仪中经过5次循环后产生等长的目的基因片段有

个；（6）含目的基因的DNA分子在PCR仪中经过n次循环后产生等长的目的基因片段有

个。0028222n–2n要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。如果循环n次，则共需消耗

个引物。

则共需消耗

对引物。3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物2如果循环n次，则共需消耗

个引物。

则共需消耗

对引物。2n－12n+1－2两种引物都结合在DNA模板链的

端；脱氧核苷酸连接在引物的

端进行延伸。3’设计引物的依据是？已知目的基因两端（3’端）的部分核苷酸序列，以便根据该序列合成引物。

3’3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物2呈指数形式扩增（n次扩增后，DNA数量约为2n）PCR结果：①n代后，DNA分子有_____个

②n代后，DNA链有_____条③第____代出现完整的目的基因

④n代后，含引物的DNA分子有_____个⑤n代后，共消耗_____个引物

⑥第n代复制，消耗了______个引物⑦n代后，完整的目的基因有____个2n2n+132n2n+1-22n2n-2n如何对产物进行鉴定？琼脂糖凝胶电泳

DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。思考?琼脂糖凝胶电泳梳子模具根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配置琼脂糖溶液，一般配置质量体积比为0.8%~1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。1将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。2待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。3点样孔电泳槽样品将电泳缓冲液加入电泳槽中，电容缓冲液没过凝胶1mm为宜。4将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。5接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为

1∼5V/cm2。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。6取出凝胶，至于紫外灯下观察和照相。7PCR技术与细胞内DNA复制的比较比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式场所引物酶温度结果联系解旋酶催化，边解旋边复制高温变性解旋，全部解旋后再复制主要在细胞核内细胞外(主要在PCR扩增仪内)RNA通常是DNA解旋酶、DNA聚合酶等耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）细胞内温和条件在不同温度(较高)下进行合成整个DNA分子扩增特定的DNA片段或基因①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板③原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）②酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3’端合成子链1.目的基因的获取和筛选【三点提醒】①在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。②引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段；PCR引物一般为DNA片段。③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。脱氧核苷三磷酸PCR技术是分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用DNA的半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图所示)，在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。(1)PCR的全称是_________________________94℃高温使DNA双链打开，这一步是打开______键，称为_______。而这一过程在细胞内是通过______酶实现的。(2)当温度降低时，引物与模板_____端结合，在___________________的作用下，DNA单链沿模板延伸，此过程中原料是_______________，遵循的原则是________________________。(3)PCR技术的必要条件除模板、原料、ATP、酶以外，至少还需要三个条件，即液体环境、适宜的_______和________，前者由PCR仪自动调控，后者则靠_________来维持。聚合酶链式反应氢变性解旋耐高温的DNA聚合酶脱氧核苷酸碱基互补配对原则温度pH缓冲液(4)DNA的复制需要引物，其主要原因是__________________________

___________________________________________________。引物的实质是_______________________________，若将1个DNA分子拷贝10次，则需要在缓冲溶液中至少加入__________个引物。单链RNA或者单链DNA分子

金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过聚合酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：(1)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的___________________________位点。设计引物时需要避免引物之间出现___________________，干扰引物与模板的结合。(2)图中步骤1代表_____________，步骤2代表复性，步骤3代表____，这三个步骤组成一轮循环。(3)PCR扩增时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会影响_________________________的碱基配对。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但_____________的引物需要设定更高的复性温度。限制性内切核酸酶切割碱基互补配对变性(解旋)延伸引物与模板GC含量高(4)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有_____。(填序号)①升高复性温度②降低复性温度③重新设计引物②③

一段特殊DNA序列，位于基因的上游，是RNA聚合酶的识别和结合位点，启动转录过程。一段特殊DNA序列，位于基因的上游，终止转录。筛选含目的基因(重组DNA分子)的受体细胞基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。基因表达载体的组成【说明】有时为了满足应用需要，会在载体上人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别

项目启动子终止子起始密码子终止密码子化学成分位置作用DNA片段DNA片段mRNA上三个相邻碱基mRNA上三个相邻碱基目的基因首端目的基因尾端mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出RNA决定转录的结束翻译的起始信号决定翻译过程的结束不编码氨基酸编码氨基酸启动子与终止子位于DNA分子中，起始和终止转录过程。启动密码子与终止密码子位于mRNA分子中，起始和终止翻译过程。(1)基因工程中的基因表达载体≠载体：基因表达载体与载体相比增加了

。

目的基因(2)目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入

，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。启动子和终止子之间的部位注意:基因表达载体的构建（基因工程的核心）重组DNA分子限制酶目的基因限制酶切割位点获取目的基因DNA连接酶基因表达载体构建模式图限制酶启动子限制酶切割位点终止子标记基因复制原点质粒同种限制酶或能产生相同末端的限制酶基因表达载体的构建（基因工程的核心）①单酶切单酶切缺点:质粒重新环化目的基因自身环化质粒与目的基因反向连接基因表达载体的构建（基因工程的核心）②双酶切的优点:防止质粒重新环化防止质粒与目的基因反向连接防止目的基因自身环化请结合下图，回答问题：

构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？不能因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。【核心归纳】图解限制酶的选择原则（1）不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ。（2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。（3）确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（或为了保证目的基因和质粒发生定向连接），可选用什么限制酶？可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒。下图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列叙述错误的是A.应选择的限制酶组合是酶F和酶GB.所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因C.用含氨苄青霉素的培养基筛选出

含重组质粒的受体菌D.同时用三种限制酶处理图中质粒，电泳后可得到4个条带注：AmpR：氨苄青霉素抗性基因，TetR：四环素抗性基因C转化：目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达方法：植物细胞：动物细胞：微生物细胞：花粉管通道法、农杆菌转化法、显微注射技术Ca2+处理法(感受态细胞法)由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此，基因表达载体的构建也会有差别；将目的基因导入受体细胞花粉外源DNA花粉管子房胚珠1.花粉管通道法：②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。我国科学家独创的一种方法吸引农杆菌向受伤组织集中双子叶、裸子植物伤口分泌酚类物质和糖类物质受损将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞中，并且将其整合到该细胞染色体DNA上。2.农杆菌转化法激活Vir区基因，导致T-DNA加工和转移特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。农杆菌特点：a.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力；b.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上；c.利用农杆菌进行转化的方法：可转移的DNA第一次拼接第二次拼接第一次导入第二次导入农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析a.两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的

上；第二次拼接（非人工操作）指被插入目的基因的T­DNA拼接到受体细胞

上。b.两次导入：第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入

第二次导入（非人工操作）是指含目的基因的

导入受体细胞。T­—DNA染色体DNAT­—DNA农杆菌农杆菌转化的具体方法：a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；体细胞b.可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。受精卵受体细胞为？受体细胞为？【说明】随着转化方法的突破，利用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。表达载体提纯受精卵胚胎雌性动物的输卵管或子宫内显微注射早期胚胎培养胚胎移植新性状的动物发育3.显微注射法将目的基因导入受体细胞病毒介导法（主要用于导入动物细胞）

科学家也用病毒DNA

与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。转基因动物Ca2+

用CaCl2处理大肠杆菌，增加细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入宿主细胞。感受态细胞吸收大肠杆菌感受态细胞Ca2+混合表达载体缓冲液溶于吸收DNA，完成转化Ca2+处理法使大肠杆菌处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态受体细胞植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法显微注射技术感受态细胞法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程以农杆菌转化法为例：将目的基因插入Ti质粒的T­DNA上↓转入农杆菌中↓导入植物细胞↓整合到受体细胞的DNA上提纯含目的基因的表达载体↓显微注射↓受精卵发育↓具有新性状的个体Ca2＋处理细胞↓感受态细胞↓基因表达载体与感受态细胞混合↓感受态细胞吸收DNA分子

在棉花细胞中，重组表达载体是否导入成功？是否可以稳定维持并表达出Bt蛋白？表达出的Bt蛋白是否具有杀虫的功效？4.目的基因的检测与鉴定检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。1.目的：2.检测内容及方法：类型检测内容方法分子水平的检测个体生物学水平的鉴定受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因目的基因是否转录出了mRNAPCR等技术目的基因是否翻译成蛋白质抗原-抗体杂交技术个体是否具有相应性状抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等DNA分子杂交（Southern-blot)流程图分子水平的检测——基因是否插入染色体DNA（存在）非转基因棉花转基因抗虫棉阴性对照Marker方法：PCR扩增或DNA分子杂交技术DNA分子杂交结果图分子水平的检测——基因是否转录方法：RT-PCR或分子杂交技术RNA分子杂交(NorthernBlot)流程图Bt基因在抗虫棉中的表达从左至右依次是苗期叶片、花铃期叶片，苞叶，花，雌雄蕊和铃壳Bt抗虫蛋白4.目的基因的检测与鉴定分子水平的检测——基因是否翻译为蛋白质方法：抗原-抗体杂交技术苏云金芽孢杆菌提取Bt毒蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交4.目的基因的检测与鉴定个体生物学水平的鉴定——个体是否具有相应性状方法：抗虫鉴定、抗病鉴定、抗虫或抗病接种实验与天然产品的功能进行活性比较接种棉铃虫观察性状表现，或采摘抗虫棉的叶子饲喂棉铃虫，观察抗虫效果。个体生物学水平的鉴定具体方法举例转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐碱植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）接种实验未染病一定浓度的盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题：(1)将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是_______；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为_________。该方法中农杆菌的作用是______________________________________________________。Ti质粒T－DNA感染烟草细胞，把目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上(2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用HindⅢ和SalⅠ两种酶的好处是____________________________________________________________________。防止目的基因自连和质粒自连，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率(3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？____(填“是”或“否”)。为什么？__________________________________________。否含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏科学家通过利用PCR定点突变技术改造Rubisco酶基因，提高了光合作用过程中Rubisco酶对CO2的亲和力，从而显著提高了植物的光合作用速率，请回答下列问题：（1）PCR过程所依据的原理是_______________，该过程需要加入的酶是________________________。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成_______________。（2）该技术不直接改造Rubisco酶，而通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造，其原因是______________________________________。和传统基因工程技术相比较，定点突变技术最突出的优点是__________________________________，PCR定点突变技术属于________________的范畴.（3）可利用定点突变的DNA构建基因表达载体，常用__________________将基因表达载体导入植物细胞，将该细胞经植物组织培养技术培育成幼苗，从细胞水平分析所依据的原理是__________________________。DNA双链复制耐高温的DNA聚合酶（或Taq酶）引物能生产出自然界不存在的蛋白质蛋白质空间结构较为复杂，改造困难蛋白质工程农杆菌转化法植物细胞的全能性5.DNA片段的扩增及电泳鉴定1.DNA体外扩增的原理：PCR利用DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。2.DNA片段电泳鉴定的原理：DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。如何对PCR产物进行鉴定吗？琼脂糖凝胶电泳PCR反应体系的配方10倍浓缩的扩增缓冲液5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1～5U/μL的TaqDNA聚合酶1～2U模板DNA5～10μL总体积50μL注：模板DNA的用量为1gp～1μg方法步骤

用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。1.PCR加样：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。循环程序变性复性延伸预变性94℃，5min30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后1次94℃，1min55℃，30s72℃，1min2.离心：3.扩增：将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。

根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。4.配制琼脂糖溶液：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。

将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。

凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。5.制备凝胶：将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。

将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。6.电泳加样：7.电泳、观察：

接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。【思考】用PCR技术可以扩增mRNA吗？mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。由mRNA逆转录形成cDNA的过程是：第一步，逆转录酶以RNA为模板合成一条与DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；第二步，核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的使之变成单链DNA；第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另DNA链，形成双链DNA分子(图3-1)。(2021·全国甲卷)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是______________(用数字序号表示)。(2)操作③中使用的酶是_____________________________。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中复性的结果是____________________________。④②③①

耐高温的DNA聚合酶

延伸

引物结合到互补DNA链

(3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与____________

______________特异性结合。(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指_______________________________

_________________________________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。病原菌的DNA解旋成的单链

在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术

新冠疫情的快速控制，离不开政府的科学决策和我国对新冠病毒(RNA病毒)的快速检测能力。荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，其原理是：在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接受到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图)。Ct值(循环阈值)的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。下列说法不正确的是(

)A．检测新冠病毒时，需加入逆转录酶将新冠病毒RNA转化为cDNAB．PCR每个循环包括变性、复性(引物和模板结合)、延伸3个阶段C．Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性更高D．若样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，检测结果可能为阴性解析Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越少，患者危险性更低，C错误；若样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，则逆转录无法得到相应DNA，检测结果可能为阴性，D正确。(2021·湖南选择性考试节选)M基因编码的M蛋白在动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验，将外源DNA片段F插入M基因的特定位置，再通过核移植、胚胎培养和胚胎移植等技术获得M基因失活的转基因克隆动物A，流程如图所示。回答下列问题：(1)在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是_____________________________，这类酶能将特定部位的两个核苷酸之间的__________________断开。(2)在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是_________________________________

__________________________________________________。(3)与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低，原因是_____________________________________________________________

______________________________。从早期胚胎中分离获得的胚胎干细胞，功能上具有___________________。限制性内切核酸酶(限制酶)

磷酸二酯键

清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害，同时给细胞提供足够的营养

动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难

发育的全能性

(4)鉴定转基因动物：以免疫小鼠的______淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选融合杂种细胞，制备M蛋白的单克隆抗体。简要写出利用此抗体确定克隆动物A中M基因是否失活的实验思路_______________________

__________________________________。B

取克隆动物A的肝组织细胞，提取蛋白质进行抗原—抗体杂交(1)CBHⅡ基因两端需添加相关酶切位点才能与pUT质粒连接，因此在扩增CBHⅡ基因时，需要在两种引物上分别添加_____________序列和___________序列。PCR中需要添加引物的原因是______________________

__________________________________________。AGATCT

GGTAACC

使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸

(2)为鉴定重组质粒是否构建成功，将重组质粒导入A菌，并将其接种在含____________的培养基上培养，然后提取3个不同菌落的质粒分别进行双酶切验证将酶切片段和CBHⅡ基因分别进行电泳，结果如下图2所示。据此分析，菌落_________中成功导入了重组质粒。完整的重组质粒应包括___________________