DB51-T 2964-2022口岸松材线虫疫情监测技术规范

ICS65.020CCSB16

DB51四 川 省 地 方 标 准DB51/T2964—2022口岸松材线虫疫情监测技术规范Technicalstandardformonitoringthepinewoodnematodeatports20222022122720230201四川省市场监督管理局发布目 次前言 II1范围 12规性用件 13术和义 14监范围 35应监的物其品 36制监计及施案 37监方法 38实室测 49监样的存处理 610测果理 6附A（料附）材虫关7附C（料附）材虫介及特征 11附附C（料附）材虫介及特征 11附D（料附）材虫其似种 17附E（范附）异PCR定法 26附F（范附）时光PCR定法 28附G（范附）DNA形码 30参考献 32前 言本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。丽华、宿白玉、刘国瑛、张军、刘俊。本文件为首次发布。口岸松材线虫疫情监测技术规范范围（GB/T23476-2009松材线虫病检疫技术规程GB/T23478松材线虫普查监测技术规程SN/T1132-2002松材线虫检疫鉴定方法SN/T2757植物线虫检测规范SN/T4350-2015旅客携带物和邮寄物检疫鉴定和处理程序3术语和定义SN/T2757植物线虫检测规范SN/T4350-2015旅客携带物和邮寄物检疫鉴定和处理程序3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1口岸port是国家批准对外开放，允许人员、货物、交通工具、寄递物等进出国境的地方。3.2松材线虫pinewoodnematode学名：Bursaphelenchusxylophilus(Steiner&Buhrer)Nickle,1970habddaTenchnapheenhodeapheenhoddae寄生滑刃亚科（Parasitaphelenchinae），伞滑刃属（Bursaphelenchus），能引起松树萎蔫病，是针叶树A。3.3媒介昆虫intermediaryinsect能携带松材线虫并能将松材线虫传递给寄主树木的天牛。在自然条件下，松材线虫需依靠墨天牛属（Monochamus）的天牛实现近距离传播。3.4松褐天牛MonochamusalternatusHope,1843又名松墨天牛、松天牛，属于天牛科（Cerambycidae）、墨天牛属（Monochamus），是为害松树的一种蛀干性昆虫，为传播松材线虫的主要媒介天牛。3.5云杉花墨天牛MonochamussaltuariusGebler,1830又名云杉花黑天牛，属于天牛科（Cerambycidae）、墨天牛属（Monochamus），是一种蛀干性昆虫，是松材线虫病的传播媒介昆虫。3.6木材wood带皮或不带皮的原木、锯木、木板、木片等。3.7原木rawwoods未经过干燥、化学防腐剂等处理，并未永久改变其特性的木材。3.8松木及其制品pinewoodandwoodenware指松科木材和由松科木材为原料制作的产品，包括松木木质包装材料。经人工合成或经加热、加压等深度加工的木质材料（如胶合板、纤维板等）除外。3.9木质包装材料woodpackingmaterials用于承载、包装、铺垫、支撑、加固货物的木质材料，如木板箱、木条箱、木托盘、木框、木桶、木轴、木楔、垫木、枕木、衬木等。3.10疫木diseasedwood感染松材线虫病的寄主植物及其制品，主要为松属植物及其制品。3.11蓝变blue-stain3.12海关指定监管场地customsdesignatedsupervisionsite场地3.13海关监管货物cargoundercustomssupervision3.14诱捕器监测trapmonitoring利用人工合成引诱剂来捕获松墨天牛，并检查其体内、体表是否携带松材线虫的一种监测方法。3.15松墨天牛引诱剂pinesawyerattractant对松墨天牛成虫具有引诱活性的挥发性化合物，如萜烯类等特异性植物源物质、昆虫源信息素等，需与松墨天牛诱捕器配合使用。（场地A.6SN/T1724-2006中6.26.3SN/T4350-201556B.1m～100mGB/T23478诱捕时间一般为每年的4月下旬至10月底（不同地区有差异），即松墨天牛成虫羽化初期开始，直至当年成虫羽化完毕为宜。可根据监测需要选用商品化的高效引诱剂。1d～5d1.5m～2.010d～15d1诱捕器每隔3d～5d检查一次，及时收集并清理诱捕器中的媒介天牛，并在当日送实验室检测。详细记录相关信息，填写附录表B.2。23476-2009C20℃～30h～24h0c（10m（10X～20X，2h镜检100µL～200（1050µL左右为宜。在酒精灯上以1s左右的频率通过8次10202014011100/（a）、体长/（c）/（c’）20SN/T2757按照SN/T1132-2002中附录C.2相关内容执行。按照SN/T1724-2006中附录B执行。或PCRPCR或DNAPCRPCRDNASN/T1132-2002中第D松材线虫特异PCR检测见附录E，实时荧光PCR检测见附录F，DNA条形码鉴定见附录G。8.5.2分子生物学检测依据附录E～附录G相关内容进行判定，检测结果呈阳性的可鉴定为松材线虫。复核CNAS4（应（）（（56℃30min）3附录A（）松材线虫最早于1929年从美国德克萨斯州的长叶松（Pinuspalustris）木材中分离到，被描述为AphelenchoidesxylophilusSteiner&190519711972Bursaphelenchuslignicolus1981Bursaphelenchusxylophilus（Steiner&Buhrer，1934）Nickle，1970。（20我国1982202067341871375.30112.481998年，葡萄牙海岸松发现松材线虫，这是欧盟境内首次报道该病。2009年，西班牙发现松材线虫。美国、加拿大、墨西哥、日本、韩国、西班牙、葡萄牙、中国。松材线虫通过墨天牛属（Monochamus）4d～5（M.alternatus）（M.saltuarius），（M.carolinensis），（M.galloprovincialis）122（J3与4（J1至J4），在4J3J4龄幼虫JIV（）J4。寄主（Pinusspp.）（P.massoniana）、黑（P.（P.（Abies（Picea（P.canadensis）（P.pungens）（Larixeuropaea）（L.（Cedrus（C.松属以外的寄主很少在感染松材线虫后死亡。目前仅美国报道蓝杉（Piceapungens）（Pseudotsugamenziesii）感染松材线虫后死亡。2µm。1µm的占77%（其中圆尾型占44%），超过1µm（1.46µm～3.41µm）的占23%。2005年，赵文霞等报道，4.2151.7µm，最长达2.9µm。但该线虫经灰葡萄孢培养后，所有雌虫尾均宽圆，无尾2009µm～1.2µm，较本文的群体更短。2011年，顾建锋等报道了一种美国木质包装中截获的松材µm～1µm1µm～2µm10%的雌虫尾尖突为µm～2.4µm，其余雌虫则无尾尖突或小于0.5µm。2020年，顾建锋等从辽宁红松分离2～31.8µm(0.3µm～3.2µm由此可见，无论是国内外松材线虫群体，都有不少关于雌虫尾尖突变异的报道。2µm的情况是比较罕见的，从实验室对上千批次松材12µm附录B（规范性附录）口岸松材线虫疫情监测记录表表B.1～B.2给出了口岸松材线虫疫情监测情况记录表。表B.1口岸松材线虫疫情监测抽样记录表时间口岸样品编号样品来源报关单号或邮件号来源渠道样品类型抽样场所外部症状取样部位有无天牛危害有无蓝变是否发现活虫及采取的措施取样数量备注【口岸】填写抽样所在地口岸具体名称；【样品编号】填写“关区代码+日期+2位流水号”，确保唯一性和可溯源性；【样品来源】填写样品来自哪个国家或地区；【来源渠道】填写贸易渠道、非贸易渠道；【口岸】填写抽样所在地口岸具体名称；【样品编号】填写“关区代码+日期+2位流水号”，确保唯一性和可溯源性；【样品来源】填写样品来自哪个国家或地区；【来源渠道】填写贸易渠道、非贸易渠道；【样品类型】填写货物、木质包装、旅客携带物、邮递物等；【抽样场所】填写查验场所、快件中心、监管作业场所、货物堆放场所、检疫处理场所等；【外部症状】依据抽样对象具体描述；【取样部位】依据抽样对象具体描述；【有无天牛危害】填写是或否；【有无蓝变】填写是或否；【备注】对上述内容信息进行必要补充。表B.2口岸松材线虫诱捕监测记录表口岸：注：【诱捕器编号】填写“关区代码+场所代码+2位流水号”，确保唯一性和可溯源性；【检查时间】具体到年月日；【监测地点】填写具体地点信息,如货物堆放场所、检疫处理场所或周边区域等；【地理坐标】填写具体经纬度。诱捕器编号检查时间监测地点地理坐标捕获天牛数量诱剂添加/更换情况监测点是否变更检查人附录C（资料性附录）松材线虫组介绍及鉴定特征15——松材线虫B.xylophilus（Steiner&Buhrer，1934）Nickle，1970——伪伞滑刃线虫B.fraudulentusRühm，1956（J.B.Goodey，1960）——拟松材线虫B.mucronatusMamiya&Enda，1979——锥尾伞滑刃线虫B.conicaudatusKanzaki，Tsuda&Futai，2000——鲍嘉伞滑刃线虫B.baujardiWaliaNegi，Bajaj&Kalia，2003——灰黄锦天牛伞滑刃线虫B.luxuriosaeKanzaki&Futai，2003——豆伞滑刃线虫B.douiBraasch，Gu，Burgermeister&Zhang，2004——新加坡伞滑刃线虫B.singaporensisGu，Zhang，Braasch&Burgermeister，2005——大尖尾伞滑刃线虫B.macromucronatusGu，Zheng，Braasch&Burgermeister，2008——杨伞滑刃线虫B.populiTomalak&Filipiak，2010——拟灰黄锦天牛伞滑刃线虫B.paraluxuriosaeGu,Wang,Braasch,2012——日本冷杉伞滑刃线虫B.firmaeKanzaki,Maehara,Aikawa&Matsumato,2012——韩国伞滑刃线虫B.koreanusGu,Wang&Chen,2013——吉拉尼伞滑刃线虫B.gillaniiSchönfeld,Braasch,Riedel&Gu,2013——锦天牛属伞滑刃线虫B.acaloleptaeKanzaki,Ekino,Maehara,Aikawa&Giblin-Davis,2019（）；个，P4明显，P3和P4（图C.1）（表C.1，表C.2）。注：A.侧线和雄虫尾乳突排列；B.雄虫尾乳突排列；C.交合刺形态；D.雌虫阴门盖；P1～P4.尾乳突。图C.1典型的松材线虫组线虫的特征表C.1松材线虫组雄虫交合刺和雌虫尾形特征图种类交合刺雌虫尾松材线虫（圆尾型）伪伞滑刃线虫拟松材线虫（欧洲亚种）拟松材线虫（东亚亚种）锥尾伞滑刃线虫鲍嘉伞滑刃线虫灰黄锦天牛伞滑刃线虫拟灰黄锦天牛伞滑刃线虫种类交合刺雌虫尾豆伞滑刃线虫新加坡伞滑刃线虫大尖尾伞滑刃线虫杨伞滑刃线虫日本冷杉伞滑刃线虫韩国伞滑刃线虫吉拉尼伞滑刃线虫锦天牛属伞滑刃线虫表C.2松材线虫组雌虫尾形显微特征图种类雌虫尾1雌虫尾2松材线虫（圆尾型R型）伪伞滑刃线虫拟松材线虫欧洲亚种拟松材线虫东亚亚种锥尾伞滑刃线虫拟灰黄锦天牛伞滑刃线虫豆伞滑刃线虫新加坡伞滑刃线虫种类雌虫尾1雌虫尾2大尖尾伞滑刃线虫杨伞滑刃线虫韩国伞滑刃线虫吉拉尼伞滑刃线虫锦天牛属伞滑刃线虫附录D（资料性附录）松材线虫及其近似种显微特征图D.1～图D.9给出了松材线虫及其近似种的显微特征照片。注：A.头部；B.阴门区（有阴门盖）；C～F.雄虫尾部及交合刺；G～K.雌虫尾部（通常尾端钝圆，无尾尖突；有时一些个体有尾尖突，但不超过2μm）。图D.1典型的松材线虫雌雄虫照片(标尺=10μm)注：A.持久型幼虫；B.繁殖型幼虫；C.雌虫；D.雄虫；E.繁殖型幼虫体前端；F.雌虫阴门区；G.繁殖型幼虫尾部；H.雌虫尾部；I.雄虫尾部。图D.2不同发育阶段松材线虫形态图(标尺=10μm)注：A.头部；B.生殖原基；C-I.尾部。图D.3松材线虫持久型幼虫头部和尾部显微特征图(标尺=10μm)注：23%，其余绝大部分均有或长或短的尾尖突，末端钝圆或锐尖，长1.8µm±0.7µm0.3µm～3.2µm)。但经灰葡萄孢人工培养后，所有的雌虫尾端钝圆，均无尾尖突。A～N.直接从红松样品分离到的松材线虫雌虫尾形；O.图D.4辽宁红松中分离到的松材线虫雌虫尾尖形态图(标尺=10μm)注：A.体前部；B.中食道球区；C、E.雄虫尾部；D.雌虫阴门区；F～I.雌虫尾部。松材线虫M型株系雌虫具有长约2.2µm～3.0µm的尾尖突，且经人工培养后仍如此。而松材线虫R型株系尽管有些个体会有短尾尖突，甚至有些群体大部分都有尾尖突，但尾尖突一般在人工培养后消失。目前M型松材线虫仅分布于北美，其寄主主要是冷杉属，因此，口岸检疫时发现M型松材线虫的频次极低，必要时需通过分子生物学方法核实。图D.5松材线虫M型株系(标尺=10μm)图D.6拟松材线虫东亚亚种（上面4幅）和欧洲亚种（下面4幅）雌虫尾形图(标尺10μm)注：A.头部；B.交合伞及尾乳突；C-D、F-G、J-K.雌虫尾部；E、I.雄虫尾部及交合刺；H.阴门及阴门盖。图D.7伪伞滑刃线虫（B.fraudulentus）(标尺=10μm)IJ注：IJ注：A-B.阴门；C.交合刺；D.交合伞；E-H.培养后雌虫尾部；I-L.原木中分离到的雌虫尾部图D.8豆伞滑刃线虫新种雄虫显微照片(标尺=10μm)ABCABCDEFGHKLEFGHKL注：A、B.头部；C.雌虫阴门盖；D.雌虫阴门至尾末端；E-F.培养后的雌虫尾部形态；G.木质包装中直接分离的雌虫尾部；H.雄虫交合伞；I,J.雄虫交合刺。图D.9杨伞滑刃线虫光学显微照片(标尺=10μm)附录E（）PCR试剂10PRBuer（g2+、aqMseMdH。DNA方法方法将1ddH2O200μLPCR含8μLddH2O1μL10×PCRBuffer（Mg2+free））1（），85℃加热2minPCR1μL1mg/mL蛋白酶K，56℃15min，95℃加热10minDNADNAPCR或者于-20℃）。特异PCR引物序列见表E.1。表E.1引物序列E.2.2.2特异PCR扩增反应体系及参数PCRE.2X-F/X-R℃4℃30℃特异PCR引物序列见表E.1。表E.1引物序列E.2.2.2特异PCR扩增反应体系及参数PCRE.2X-F/X-R℃4℃30℃30℃1min，35725J10-1和J10-2Rc945min；9430sec，641min，72℃1min，35725。引物名称碱基序列扩增片段长度X-F5’-ACGATGATGCGATTGGTG-3’约560bpX-R5’-TATTGGTCGCGGAACAAACC-3’J10-15’-GGTGTCTAGTATAATATCAGAG-3’约160bpJ10-2Rc5’-GTGAATTAGTGACGACGGAGTG-3’表E.2PCR试剂名称加样量μL2×TaqMasterMix预混液25正向引物（浓度10μmol/L）2反向引物（浓度10μmol/L）2DNA模板2ddH2O补足反应总体积至50μL以松材线虫DNA模板作为阳性对照，以不含松材线虫的DNA模板作为阴性对照，以ddH2O作为空白对照。配制GelRed（0.55μLPCR100bpDNAMarker3V/cm～5V/cm0.5h在阳性对照、阴性对照和空白对照正确的前提下，经琼脂糖电泳：采用X-F/X-R引物对扩增后，电泳检测得到与阳性对照一致的560bp左右大小的特有条带，或采用J10-1/J10-2Rc引物对得到160bp左右大小的特有条带，判定结果为阳性；否则判定结果为阴性。阳性对照、阴性对照和（或）空白对照不正确，无论待测样品结果如何，应重复试验。附录F（）PCR试剂10×PCRBuffer（Mg2+free）、蛋白酶K、2×TaqMasterMix预混液、ddH2O。DNA操作方法见附录E.2.1PCR引物及探针序列见表F.1。F.2.2.2实时荧光PCR反应体系及参数3F.2.2.2实时荧光PCR反应体系及参数33DNADNADNADNAPCRF.2表F.2实时荧光PCR反应体系实时荧光PCR的反应参数：95℃10min；95℃15sec，60℃45sec，共40个循环。对PCR反应管荧光信号的收集条件应与探针的荧光基团一致，具体设置方法参照相应荧光PCR仪的使用说明。F.2.3结果判定引物名称碱基序列正向引物BsatF5’-TGACGGAGTGAATTGACAAGACA-3’反向引物BSatRV5’-AAGCTGAAACTTGCCATGCTAAA-3’探针BSatS5’-FAM-ACACCATTCGAAAGCTAATCGCCTGAGA-TAMRA-3’注：探针5’端含有FAM基团的荧光染料，3’端含有TAMRA基团的荧光染料。试剂名称加样量μL2×TaqMasterMix预混液25引物BsatF（浓度10μmol/L）2引物BSatRV（浓度10μmol/L）2探针BSatS（10μmol/L）1DNA模板2ddH2O补足反应总体积至50μLPCR5～15值=40在阳性对照、阴性对照和空白对照正确的前提下：——如果待测样品的Ct值等于40时，则判定结果为阴性；——如果待测样品的Ct值小于或等于35时，则判定结果为阳性；Ct4035Ct40Ct35Ct4035附录G（DNA试剂10×PCRBuffer（Mg2+free)、蛋白酶K、2×TaqMasterMix预混液、ddH2O。DNA操作方法见E.2.128S引物序列见表G.1。表G.1引物序列引物名称碱基序列扩增片段D2A5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′约800bpD3B5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′G.2.2.2G.2.2.2PCRPCR反应体系参见附录表E.2。反应参数94℃4min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，37个循环；72℃8min。操作方法见附录E.2.3。该引物正常的PCR扩增产物片段大小为800bp左右，若样品PCR扩增获得正常产物，可送扩增产物到生物测序公司双向测序（可要求公司进行拼接），建议每个样品做3个以上重复。G.3DNAG.3.1序列拼接使用Chormas软件或其他序列分析软件，对28S基因测序得到的双向峰图文件（后缀名.ab）进行拼接。为确保DNA条形码序列的可靠性，需对测序质量进行评估，去除测序结果两端峰形杂乱的低质量序列，并去除引物所在序列区域，获得相应的DNA序列。拼接完成后，DNA序列方向应与PCR扩增正向引物方向一致并保证序列长度大于740bp。G.3.2序列比对登陆NCBI网站中的BLAST（basic local alignment search tool）页面（/Blast.cgi）进行比对。在BasicBLAST中选择nucleotideblast，在EnterQuerySequence（Per.Ident）。在BLAST结果中查看序列相似性最高的物种，一般为与查询序列最接近的物种。G.4结果判定若待测样品序列与已知的松材线虫序列（AY508107.1、EF446929.1-EF446933.1、EF446935.1、FJ768948.1EU295491.1、DQ364687.1、DQ356002.1、EU295503.1、AY508108.1、AY508105.1、MN270176.1、MW012949.1、AM396580.1等）相似性（Per.Ident值）达98.98%以上，与其他种类的相似性小于98.73%，可判定为松材线虫阳性。若待测样品序列与已知的松材线虫相似性低于98.98%，则可能不是松材线虫。如BLAST结果所显示的线虫不是伞滑刃属线虫，甚至不是线虫，很可能是实验过程中由于操作不当引入的其他微生物污染和样品交叉污染，须重复实验过程。参考文献,[M].,2011.刘伟.[J].,1995,10(2):223-225.夏永刚,王明旭,张玉荣,等.[J].湖南农业大学学报(自然科学版),2009.,[J].,2005,18(3):362-363.郑炜,,等[J].,2007(03):38-40.BraaschH,BurgermeisterW,GuJ.RevisedintragenericgroupingofBursaphelenchusFuchs,1937(Nematoda:Aphelench