结核病的实验室诊断（全省定点门诊医生培训班.6）1 结核病定点医院门诊医生规范化诊治培训班课件

结核病实验室诊断柳正卫浙江省疾病预防控制中心1结核病防治临床诊治实验检测随访督导药品供应23结核病诊治中最困扰您的是什么？我能给临床提供哪些检测结果呢？我需要哪些检测来辅助我的诊治呢？45临床医生患者实验室提供的信息越充分，越能配合治疗提供的信息越充分，诊治的效果越明显提供的信息越充分，实验室检测针对性更强6检测报告大多数是基于体外检测的结果对一份检测报告，应结合具体情况综合判断临床也应掌握检测的原理与结果的意义，便于诊治和有疑义时的解释工作临床也应关注实验室的质量控制体系7结核分枝杆菌电子显微镜下结构89一条结核杆菌在体内的繁殖情况天数结核杆菌数天数结核杆菌数天数结核杆菌数1295121713107224101024182621443811204819524288416124096201048576532138192212097152664141638428268416×103712815327683534535×10682561665536424396800×10610萋尼氏染色涂片镜检固体罗氏培养普通PCR扩增检测别离培养涂片镜检分子诊断肺结核诊断荧光染色涂片镜检液体培养荧光定量PCR扩增检测恒温扩增检测金胺O染色AFB(×40物镜)金胺O染色AFB(×20物镜)抗酸杆菌(acid-fastbacilli，AFB)镜检11LED显微镜12感染性肺结核病人的特征5,000bacilli/1mL:涂片阳性10,000bacilli/1mL:95%可能阳性痰涂片阳性的病人是主要的传染源痰涂片阴性的病人15~20%具有传染性13抗酸菌数量与镜检阴性几率比较CFU/ml痰标本直接涂片(－)几率150088.5300081.31500019.63000017.31500001.63000000---Mundy14留痰次数对痰检阳性的关系即时痰；晨痰；夜间痰；1998年Nelson等报道：采用229位患者不同时间采集的干酪样和粘液样痰标本，进行AFB镜检，虽然清晨痰的阳性率最高(47.0％)，即时痰的阳性率最低(41.7％)，但结果在临床诊断的符合率和可靠性上均无显著性差异。15Threesputumsmearsareoptimal16不同痰液涂片阳性率表

〔仅供例如〕

性质 例数 阳性数 阳性率

干酪样痰 55 36 65.5%

血性痰 46 16 34.8%

粘液性痰 529 56 10.6%

水样痰 92 7 7.6%

1718痰涂片检查登记本

实验序号日期姓名性别年龄痰标本来源标本镜检结果签名备注初诊患者(门诊序号)随访患者(患者登记号)标本性状结果日期实验室流水号

********090031A阴性

**外单位送检标本请注明来源及就诊者相关信息，以便追踪。

2B3C数字+

09002********083201D**2319分枝杆菌别离培养结核杆菌培养检查是目前结核病诊断的“黄金标准〞，如病人标本中检出结核菌，可100%确诊为结核病，并且具有传染性。理论上可检出一条菌，实际工作中只有约1/3肺结核病人为阳性；且用时较长，需4~8周左右；无法鉴定结核与非结核分枝杆菌。灵敏度略高于涂片，可以鉴定死菌与活菌，可进一步做菌种鉴定和药敏试验，为结核病流行病学及临床治疗提供用药依据。20液体培养基营养好，细菌生长快，利于快速诊断。米氏7H9液体培养基液体变色培养基底层有颗粒状沉淀，上清无色透明显色剂：四唑鎓盐→复原成粉红色甲臢21

结核杆菌快速培养仪检测BACTECMGIT960全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏仪BacT/ALERT3D全自动培养仪荧光物质包埋在7H9液体培养管的底部，分枝杆菌生长过程中，O2被消耗，底物产生荧光，仪器通过测定荧光强度，用生长指数来表示测定结果，培养时间通常需要7~42天。分枝杆菌生长过程中代谢产生CO2，CO2的产生使瓶底颜色感受器产生不同的颜色变化。通过比色传感器来测定，CO2产生的速率和总量与细菌生长的速率和总量一致。22BACTECMGIT分枝杆菌荧光判读器23分子生物学诊断利用分子生物技术作为结核菌快速检测、分型、抗药性菌株检测及测定突变，是不可阻挡之趋势，但现阶段仍无法取代传统之涂片抗酸性染色及培养，特别是药物敏感性试验。24PCR检测诊断条件临床上若痰涂片为阳性，其敏感度为80%至95%，特异度90%至98%，相反地若涂片阴性但培养阳性时，其敏感度為48%至53%，但特異度仍维持在95%，现有之资料显示临床医师在决定是否要以PCR作诊断时，必须按病人之临床表现而定，但仍无法取代传统之培养。25核酸扩增检测〔NAA〕检测规定一般收集三个不同的采集日期的标本，并分别做涂片染色镜检及结核菌培养。取第一个涂片镜检呈阳性的检体进行NAA；如果有需要，那么再收集另一套检体做确认。如果第一套检体涂片镜检及NAA检查皆呈阳性，那么可推断为结核感染。若涂片染色呈现阳性，但是NAA检查呈阴性，那么必须检查是否因PCR反响中含有核酸复製的抑制物所引起。若无抑制物的影响，且重复另一套检体的结果亦呈阴性，那么可推测病人可能感染非结核分枝杆菌〔NTM〕若涂片染色呈阴性，但NAA检查呈阳性的情形，那么必须再做另一套检体，如果得到相同结果，那么可推论此病人极可能感染结核病。如果兩者皆为阴性，那么表示这个病人并没有结核病感染。然而，单靠NAA结果并不能将病人為活动性结核的可能性完全排除，最后诊断仍需要仔细评估臨床症狀的严重度与感染结核病的可能性，以及是否接受药物治療等因素考虑进去。尤其是当分子检验结果与臨床症狀不一致时，病人的臨床病情是否高度疑心结核感染是判讀NAA结果与决定后续处置的重要依据。26LAMP试验检测结果图：绿色为阳性橙色为阴性

27改进罗氏比例法线性探针检测基于液体的药敏检测传统药敏检测耐药基因突变检测耐药性检测液体培养基因芯片检测药物MIC检测28改进罗氏比例法2930计算耐药百分比：含药培养基上生长的菌落数耐药百分比=--------------------------×100%对照培养基上生长的菌落数假设耐药百分比大于或等于1%，那么认为受试菌对该抗结核药耐药。

BBLMGIT液体药敏试验31INH:耐药Day7RIFDay5GCDay7INHRIF:敏感结果判读3233时间比较样本选择方式对照管报阳时间最终确认时间直接培养（10）3-5天5-7天次培养（15）7-13天9-13天液体培养比例法28天液体培养时间跨度GenoType®MTBDRplus

检测程序1)从用NALC/NaOH处理的痰取DNA2)PCR扩增3)杂交对扩增的特异DNA核酸进行反向杂交，探测链上的碱基对4)评价4)评价34GenoType®

MTBDRplus

利福平耐药：rpoB基因rpoB野生型-探针:WT1到WT8rpoB突变探针:MUT1-3:D516V,H526Y,H526D,S531L→通过缺失的野生型信号进行突变探测→通过出现的突变信号进行突变探测35分枝杆菌复合群中的耐药基因检测原理3637杂交试剂38

结果判读与解释39

结果判读与解释40快速耐药检测DNA微阵列芯片法414243快速耐药检测DNA微阵列芯片法第3次耐药监测MDR菌株的局部检测结果rpoB基因突变〔516G-T〕inhA基因突变〔-15C-T〕KatG基因突变〔315G-C〕44快速耐药检测-DNA微阵列芯片法目前国家参比室已发布了相关的标准操作流程45结核分枝杆菌鉴定程序46分枝杆菌菌种鉴定的意义非结核分枝杆菌的发病率在不同的国家、不同的地区报告差异很大。据资料报道，日本在1980年报告：在分枝杆菌感染中，非结核分枝杆菌的发病率为12%，并有逐年上升趋势，其中主要为鸟胞内复合群，高达89.6%，其次为堪萨斯占8.0%我国2007年耐药基线调查结果显示，我国的非结核分枝杆菌大约为3.04%。我省第3次耐药监测结果显示，我省的非结核分枝杆菌大约为3.47%4748分枝杆菌菌种鉴定的意义一般来说，非结核分枝杆菌对抗结核药物的敏感性低于结核菌，但各型和各菌株之间对药物的敏感性差异甚大。分枝杆菌的主要类型分枝杆菌结核分枝杆菌复合群非结核分枝杆菌(MTC)(NTM)麻风分枝杆菌〔M.leprae〕49分枝杆菌菌种鉴定分枝杆菌菌群鉴定的目的既是鉴定菌株属于结核分枝杆菌复合群还是非结核分枝杆菌，也是进一步菌种鉴定的根底。分枝杆菌临床别离株药物敏感性试验应与菌种初步鉴定同步进行，以对硝基苯甲酸〔PNB〕、噻吩-2-羧酸肼〔TCH〕鉴别培养基初步鉴别结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和非结核分枝杆菌鉴别培养基的制备过程略。50分枝杆菌菌种初步鉴定分枝杆菌PNBTCH28℃生长耐热触酶硝酸还原烟酸试验牛分枝杆菌——————结核分枝杆菌—+————NTM++++++51结核分枝杆菌复合群〔MTC〕鉴定方法该方法可以鉴别结核分枝杆菌复合群，包括结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌I型和Ⅱ型、牛分枝杆菌、卡介苗、田鼠分枝杆菌、caprae分枝杆菌以及canettii分枝杆菌。52非结核分枝杆菌〔nontuberculosismycobacteria，NTM〕是结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌的总称。53NTM迄今为止已发现有150余种,目前已证实50多种具有潜在致病性。分类习惯上仍采用Runyon分类法——根据菌落色素﹑生长速度分为四组54NTM非结核分枝杆菌〔nontuberculous

mycobacteria,NTM〕是指分枝杆菌属中除结核分枝杆菌及麻风分枝杆菌以外的一组分枝杆菌可导致慢性肺部疾病、淋巴结炎、皮肤和软组织感染及全身播散型NTM病等。NTM属于时机性致病菌，它的致病性和毒力均较结核杆菌低。NTM对现有抗结核药物大多耐药，所以NTM病治疗困难，预后不佳。55结核与非结核分枝杆菌的主要区别

区别点结核分枝杆菌非结核分枝杆菌菌落外形粗糙、颗粒、结节滑或粗糙菌落色泽乳酪色黄或橘红色抵抗力对酸碱有一定抗力对酸碱较敏感生长温度较严格，370C最正确范围较宽25~400C生长速度慢4~8周快〔1周内)慢2~4周感染途径呼吸、消化道接触感染致病性致病菌多为条件致病菌所致疾病人和动物结核病各部位NTM病治疗对抗痨药敏感常耐抗痨药物

56大量研究以及临床治疗病例说明多数传统抗TB药对NTM病很少或没有活性，所以NTM病治疗困难，预后欠佳。57NTM医院感染的爆发流行医院内感染系指在医院内获得的感染，其发病可以在住院期间，也可以在出院后，可以是散在发生，也可以是爆发流行。58非结核分支杆菌医院感染的爆发流行NTM作为医源性感染或医院感染病原体的报道那么始于1973年自70年代中期至1996年国外文献至少有25起NTM医院感染爆发事件，病例数600以上，每起3～298例不等，均属快速生长NTM，尤以龟分支杆菌及脓肿分支杆菌更常见。1996年中国台湾报道3年期间22例快速生长分支杆菌〔龟分支杆菌19例、偶然分支杆菌3例〕角膜炎，深圳脓肿分支杆菌引起的医院感染爆发事件，59NTM医院感染爆发流行事件

深圳市于1998年4~6月发生一起脓种分枝杆菌引起的院内术后感染爆发流行事件。该院在4~6月期间共做手术292例，其中168人发生手术切口感染，感染率为57.5%，为国内