巨噬细胞IL-10和TNF-α在人慢性牙周炎牙龈组织中表达的研究分析 医学专业

暨南大学硕士学位论文题名（中英对照）：巨噬细胞IL-10和TNF-α在人慢性牙周炎牙龈组织中表达的研究IL-10andTNF-αexpressiononmacrophageingingivaltissueofhumanchronicperiodontiti中文摘要背景及目的：牙周病（periodontitisdiseases）是发生于牙齿周围组织的炎症性疾病，为口腔两大疾病之一，是导致牙齿脱落的主要原因。牙周炎被认为是多因素疾病，目前认为牙周病的始动因子为牙菌斑生物膜。牙周致病菌不仅对牙周组织造成直接损伤，还可以通过刺激、调控宿主的免疫防御系统间接损伤牙周组织，目前认为这种免疫炎症反应对牙周组织的损伤远超过了微生物对组织的直接作用。巨噬细胞（microphage,Mφ）是机体防御反应的第一道防线，是固有免疫的重要组成部分，能对细菌或异物进行识别、吞噬以及清除。IL-10（interleukin-10）是一种多功能细胞因子，可抑制T淋巴细胞功能以及单核/巨噬细胞的活化和效应作用，对不同类型的造血细胞也发挥不同的作用。IL-10主要由Th2细胞产生，能有效抑制IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、GM-CSF、TNF（tumornecrosisfactor）等Th1细胞因子，从而发挥抑炎作用。TNF-α主要由活化的Mφ和Th1细胞分泌的细胞因子，作用于血管内皮细胞，诱导其合成黏附因子，进而使白细胞尤其是中性粒细胞（neutrophil）以及单核细胞（monocytes）向血管内皮细胞（endothelialcells，EC）黏附以及向组织内游出，从而发挥抗炎的作用。IL-10、TNF-α参与了Th细胞免疫应答的调控过程。目前有关Mφ表达IL-10、TNF-α在慢性牙周炎领域尚未见报道。本研究通过观察慢性牙周炎的牙龈组织中Mφ表达IL-10、TNF-α的情况，分析Mφ分泌的IL-10、TNF-α在牙周感染中的作用及其作用机制。研究结果将对后续以MφIL-10、TNF-α为靶点研究慢性牙周炎的免疫预防提供分子理论基础和实验依据。方法：选取自愿接受研究的80名慢性牙周炎患者，依据慢性牙周炎的分类标准分为4组：1)正常对照组20例；2)轻度慢性牙周炎组20例；3)中度慢性牙周炎组20例；4)重度慢性牙周炎组20例。牙龈标本采用10%中性福尔马林固定液浸泡处理，浸泡时间超过48h，制作颊舌向5μm的牙龈组织切片。H&E染色后光学显微镜下观察其组织学变化。采用免疫组织化学技术（immunohistochemistry,IHC)，在光学显微镜下观察组织中Mφ（CD14+）募集以及CD14+、IL-10+、TNF-α+的表达，并计算出平均阳性细胞率；然后采用免疫荧光双染色（doubleimmunofluorescence,DIF）进行染色，在荧光显微镜及共聚焦显微镜下观察牙龈组织标本中的CD14+-IL-10+及CD14+-TNF-α+，并计算CD14+-IL-10+、CD14+-TNF-α+的细胞密度(cells/mm2)。采取统计学软件SPSS13.0对计算所得数据作分析和处理，采用Wilcoxon符号秩检验、Kruskal-WallisH检验、Nemenyi法检验、单因素方差分析(one-wayANOVA)和Pearson相关分析，P＜0.05时认为差异有统计学意义。结果：1、组织学观察结果1）与正常对照组对比，三组慢性牙周炎患者的牙龈组织中炎症细胞均显著增加(P＜0.01)；2）随着牙周炎病变程度的加重，牙龈组织中炎症细胞显著增加(P＜0.01)。2、免疫组织化学染色结果1）与正常组对比，三组慢性牙周炎患者的CD14平均阳性细胞率均显著上升(P＜0.01）；2）与正常组对比，三组慢性牙周炎患者的IL-10平均阳性细胞率表达水平均显著下降(P＜0.01)；3）与正常组对比，三组慢性牙周炎患者的TNF-α平均阳性细胞率表达水平均显著上升(P＜0.01)。3、免疫荧光双染色结果1）与正常组对比，三组慢性牙周炎患者的CD14+-IL-10+细胞密度均显著下降(P＜0.01)；2）与正常组对比，三组慢性牙周炎患者CD14+-TNF-α+细胞密度均显著上升(P＜0.01)。4、慢性牙周炎的病变程度与Mφ平均阳性细胞率、CD14+-IL-10+细胞以及CD14+-TNF-α+细胞三者之间的相关性经Pearson相关分析，结果显示：1）慢性牙周炎的病变程度与各组Mφ平均阳性细胞率、CD14+-TNF-α+细胞密度之间的相关性为显著的正相关的关系；2）慢性牙周炎的病变程度与CD14+-IL-10+细胞密度之间的相关性为显著的负相关的关系。结论：1、Mφ平均阳性细胞率随着牙周炎的严重程度的加重而显著上升。2、CD14+-TNF-α+细胞密度随着牙周炎的严重程度的加重而显著上升。3、CD14+-IL-10+细胞密度随着牙周炎的严重程度的加重而显著下降。在牙周炎的过程中，牙龈组织中的Mφ参与了牙周的抗感染免疫应答；Mφ分泌的IL-10、TNF-α在慢性牙周炎过程中，通过抑炎和抗炎作用在免疫调控中可能起到关键性因子的作用。关键词：慢性牙周炎；巨噬细胞；IL-10；TNF-αAbstractBackgroundandobjectivePeriodontitisareinflammatorydiseasesthatoccurinperiodontaltissues,leadingtothelossofteeth.Periodontitisisconsideredtobeamultifactorialdisease,anditiscurrentlybelievedthattheplaquebiofilmisafactorinthepathogenesisofperiodontaldisease.Periodontalpathogensnotonlycausedirectdamagetotheperiodontaltissues,butalsoindirectlydamagetheperiodontaltissuesbystimulatingandregulatingthehost'simmunedefensesystem.Atpresent,itisbelievedthatthedamageoftheperiodontaltissuebythisimmuneandinflammatoryreactionfarexceedsthedirecteffectofthemicroorganismonthetissue.Althoughmuchresearchhasbeenconductedontheimmunemechanismsofperiodontaldisease,thetypeofimmunecellsinvolvedinperiodontaldiseaseandtheimmunemechanismshasnotbeenelucidated.Mφ(Macrophage)isthefirstlineofdefenseofthebody'sdefenseresponsewhichisanimportantcomponentofinnateimmunity.Itcanrecognize,phagocytose,andremovebacteriaorforeignbodies.IL-10(interleukin-10)isamultifunctionalcytokinethatinhibitsTlymphocytefunctionandtheactivationofmonocytes/macrop-ages.Therearealsodifferencesintheeffectsofdifferenttypesofhematopoieticcells.IL-10ismainlyproducedbyTh2cellsandcaneffectivelyinhibitIL-1α,IL-1β,IL-6,IL-12,GM-CSF,TNF(tumornecrosisfactor)andothercytokines,thusplayingananti-inflammatoryrole.TNF-αismainlycomposedofactivationofMφandTh1cellssecretecytokinesecretioninvascularendothelialcells,inducingthesynthesisadhesionfactor,thusmakesleucocyteespeciallyneutrophilsandmononuclearcells,monocytestovascularendothelialcells(EC)adhesionandswamouttotheorganization,soastoplaytheroleofanti-inflammatory.Il-10andTNF-αwereinvolvedintheregulationofThcellimmuneresponse.Atpresent,thereisnoreportontheexpressionofIl-10andTNF-αMφinchronicperiodontitis.Inthisstudy,WeobservedtheexpressionofIl-10andTNF-αMφinchronicperiodontitisgingivaltissue,andanalyzedtheroleandmechanismofIL-10andTNF-αinperiodontalinfection.Theresultsofthestudywillprovidetheoreticalbasisandexperimentalbasisforthefollow-upstudyontheimmunecontrolofchronicperiodontitis,whichistargetedbyMφIL-10andMφTNF-α.MethodsEightypatientswithchronicperiodontitiswhovolunteeredtoreceivethestudyweredividedintofourgroupsaccordingtotheclassificationcriteriaofchronicperiodontitis:1)20patientsinthenormalcontrolgroup;2)20patientsinthemildchronicperiodontitis;3)20patientsinthemoderatechronicperiodontitis;4)20patientsintheseverechronicperiodontitis.Gingivalspecimensweresoakedin10%neutralformalinandsoakedformorethan48hours,andthebuccaltonguewasmadetothegingivaltissueof5μm.AfterH&Estaining,histologicalchangeswereobservedunderalightmicroscope.ImmunohistochemicalstainingwasusedtoobservetherecruitmentofMφ(CD14+)andtheexpressionofCD14+,IL-10+andTNF-α+inthetissueunderanopticalmicroscope,andtheaveragepositivecellratewascalculated.TheCD14+-IL-10+andCD14+-TNF-α+inthetissuesamplesofthegingivaltissuewereobservedunderfluorescencemicroscopeandconfocalmicroscopy,andthedensityofCD14+-IL-10+andCD14+-TNF-α+(cells/mm2)wascalculated.ThestatisticalsoftwareSPSS13.0wasusedtoanalyzeanddealwiththecomputeddata,usingWilcoxonsymbolranktest,Kruskal-wallisHtest,Nemenyimethodtest,Singlefactorvarianceanalysis(one-wayANOVA)andPearsoncorrelationanalysis,P＜0.05thedifferencewasregardasstatisticallysignificant.Results1.Histologicalobservations1)Comparedtothenormalcontrolgroup,inflammatorycellsinthegingivaltissuesofthreegroupsofchronicperiodontitisweresignificantlyincreased(P<0.01);2)inflammatorycellsinthegingivaltissueincreasedsignificantlywiththeseverityofperiodontitis(P<0.01).2.Immunohistochemicalstainingresults1)Comparedtothenormalgroup,theexpressionstandardofCD14averagepositivecellsinthreegroupsofchronicperiodontitisremarkablyincreased(P<0.01);2)Comparedtothenormalgroup,theexpressionstandardofIL-10averagepositivecellsinthreegroupsofchronicperiodontitisreducedremarkably(P<0.01);3)Comparedtothenormalgroup,theexpressionstandardofTNF-αaveragepositivecellsinthreegroupsofchronicperiodontitisincreasedsignificantly(P<0.01).3.Immunofluorescencedoublestainingresults1)Comparedwiththenormalgroup,theCD14+-IL-10+cellsdensityinthethreegroupsofchronicperiodontitiswassignificantlyreduced(P<0.01);2)Comparedwiththenormalgroup,thedensityofCD14+-TNF-α+cellsinthethreegroupsofpatientswithchronicperiodontitisincreasedsignificantly(P<0.01).4.CorrelationbetweenthedegreeofchronicperiodontitisandtheaveragepositiverateofMφ,CD14+-IL-10+cellsandCD14+-TNF-α+cellsByPearsoncorrelationanalysis,theresultsshowedthat:1)ThecorrelationbetweenthedegreeofchronicperiodontitisandtheaveragepositivecellrateofMφandCD14+-TNF-α+celldensitywasasignificantpositivecorrelation;2)ThecorrelationbetweenthedegreeofchronicperiodontitisandtheaveragepositivecellrateofCD14+-IL-10+celldensitywasasignificantnegativelycorrelation.Conclusion1.TheaveragepositivecellrateofMφincreasedsignificantlywiththeseverityofperiodontalinflammation.2.TheCD14+-TNF-α+celldensityincreasedsignificantlywiththeseverityofperiodontalinflammation.3.TheCD14+-IL-10+celldensitydecreasedsignificantlywiththeseverityofperiodontalinflammation.Theprocessofperiodontitis,Mφingingivaltissueparticipatesintheperiodontalanti-infectiousimmuneresponse.IL-10andTNF-αsecretedbyMφmayplayakeyroleinimmuneregulationthroughanti-inflammatoryandanti-inflammatoryeffectsduringchronicperiodontitis.KeywordsChronicperiodontitis;Macrophage;IL-10;TNF-α目录中文摘要……………..Ⅰ英文摘要………….Ⅳ目录…………………..Ⅷ前言…………………...11.牙周病的病因和发病机制………..12.Mφ分泌的IL-10与牙周炎关系的研究进展…….33.Mφ分泌的TNF-α与牙周炎关系的研究进展…………………...84.本课题的研究目的和意义……….10材料与方法…………..121.实验器材…………122.病例选择、分组及标本收集…………………….143.实验操作方法…………………….154.统计学分析……………………….20结果…………………..21组织学观察结果…………………21免疫组织化学染色观察结果……………………22免疫荧光双染色染色观察结果……………...….25免疫阳性细胞与慢性牙周炎程度相关性分析结果……………28讨论…………………..31巨噬细胞参与人慢性牙周炎的免疫调节过程…………………31双阳性巨噬细胞在慢性牙周炎牙龈组织中的表达及意义……32结论…………………..35参考文献……………..36附录一………....……………………..45附录二（附图）……………………..48附录三知情同意书…....……………..72前言1.牙周病的病因和发病机制牙周病（periodontitisdiseases）是发生于牙齿周围组织的炎症性疾病，为口腔两大疾病之一，是导致牙齿脱落的主要原因。依据累及部位的不同分为累及牙龈组织的牙龈病，以及累及牙周支持组织的牙周病两种ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[1]。牙周炎被认为是多因素疾病，目前认为牙周病的始动因子为牙菌斑生物膜及其产物，部分牙周致病菌所形成的抗原成分以及在其代谢的过程中所生成的酶以及毒素均可直接对牙周组织造成损伤，因此牙菌斑与牙周炎病程的进展密切相关ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[2]。牙周致病菌不仅对组织造成直接损伤，还可以通过刺激、调控宿主的免疫防御系统间接损伤牙周组织。牙周致病菌本身无法诱发产生牙周炎，已经有越来越多的研究结果显示，在疾病的发展过程中，机体的免疫系统处理感染因子的过程起到主要的作用。Th1以细胞免疫为主而Th2细胞以体液免疫为主，Th1、Th2之间的平衡状态被认为是维持全身免疫系统内环稳定的重要因素，它们的异常分泌将引起炎症过程的失衡ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[3-8]。在相关的慢性牙周炎的临床资料中以及实验中显示，在牙周炎的早期稳定阶段，Th1细胞及其细胞因子起到主要的作用，在牙周组织病变程度加重时，Th2细胞起到主要作用ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[9-11]。通过对牙龈沟液中所含的细胞因子的浓度加以分析对比，研究显示前列腺素2(prostaglandin,PGE2)、IL-1α、干扰素γ（interferon-γ,IFN-γ）以及IL-2的浓度是增加的，IL-4、IL-6的浓度是减少的，可以推断在牙周组织的病变过程中，Th1型细胞因子的表达水平比Th2型细胞高ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[12]。在牙周炎形成、发展以及转归过程中，以IFN-γ、TNF-α为代表的Th1型细胞因子和以IL-4、IL-10为代表的Th2型细胞因子起到十分重要的作用。根据医学调查相关数据显示，我国轻度或重度牙周炎的成年人患者达80%-97%ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[13]。研究表明，牙周炎不仅仅是引起牙齿脱落的重要因素，并且易影响全身健康而引起呼吸道疾病、心血管疾病以及风湿性关节炎等疾病ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[14-15]。有学者研究认为慢性牙周炎产生的细菌酶可能破坏了口腔粘膜表面，改变了呼吸道上皮通透性，从而降低宿主非特异性防御机制对潜在呼吸道病原菌的抵抗作用ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[16-17]。根据相关医学调查报告中的数据，口腔的卫生情况对于口腔疾病和呼吸道疾病有着较大的影响，其中口腔卫生状况差的患病几率要比有着良好口腔卫生习惯的人群的患病几率高出450%。研究发现，导致呼吸道疾病的因素可能是因为牙周炎的炎症介质进一步感染。此外，当前有研究认为其他疾病也可能导致牙周炎的发生，如糖尿病患者病程后期多伴随牙周炎，因此牙周炎被认为是糖尿病的并发症之一ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[18]。牙周炎是由多类牙周致病菌、大量的炎性介质和多种不同的免疫细胞之间共同作用的结果，主要特点为牙周结缔组织的破坏、牙槽骨的吸收以及牙周附着水平的丧失。当前，在牙周炎的免疫应答机制上尽管已经作了大量的实验研究，但是，在引起牙周炎的感染的细胞因子以及相关的免疫机制仍未明确。2、Mφ分泌的IL-10与牙周炎关系的研究进展2.1IL-10的结构IL-10是一种多功能细胞因子，可以抑制T淋巴细胞以及单核细胞、Mφ的活化与效应，对不同类型的造血细胞的作用也存在差异ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[19]。在以往的研究中发现IL-10最早是由Th2细胞所诱导生成的，其抑制IL-2、TNF-α、INF-γ等细胞因子的产生。有研究报道，B细胞和B细胞淋巴瘤也发现产生IL-10，由此可推断在对宿主的免疫应答机制的抑制作用上，IL-10以及其同源物起到关键性作用。人类hIL-10基因由相应染色体上的5个外显子编码，激活的IL-10基因导致2kbhIL-10mRNAs表达ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[20-25]。IL-10可以由多种细胞表达，它的表达受到不同细胞类型不同机制的调控，在T细胞、单核细胞及Mφ中，IL-10转录可以被转录信号肽1(signalpetide,SP)和转录因信号肽3调控，转录因子SP1和SP3由许多不同的细胞类型组成表达ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[26-27]。研究显示，IL-10抑制Mφ的信号通路需要信号转导和转录激活因子3（Signaltransducerandactivatoroftranscription3，stat3），IL-10受体末端15个氨基酸片段与Stat3一起在IL-10发挥作用，抑制Mφ的活化，目前认为stat3是所有IL-10应答细胞中信号传导所必须的，但必须激活一种或多种途径实现IL-10对Mφ活化的抑制ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[28-30]。2.2IL-10的生物学效应IL-10对于单核细胞、Mφ以及树突状细胞（dendriticcells,DCs）都存在影响。IL-10能有效抑制IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、GM-CSF、TNF等细胞因子的表达。在抗炎过程中，IL-10占据主要的作用，并且能够抑制TNF和IL-1的产生。在炎症的发生发展过程中，以上的细胞因子起到相互协同的作用，并且能够诱导炎症介质前列腺素（prostaglandin,PGE）、单核细胞趋化蛋白1（monocytechemoattractantprotein1,MCP1）、Mφ炎症蛋白1α（macrophageinflammatoryproteins1α,Mip-1α）、Mip-1β、Mφ衍生趋化因子（macrophage-deprivedchemokine,MDC），由此可推断IL-10抑制大多数炎症细胞因子的表达ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[31-32]。IL-10通过抑制基质金属蛋白酶2生成的作用从而抑制单核细胞及Mφ外基质转换的能力，反而使金属蛋白酶组织抑制剂以及透明质酸（hyaluronicacid）的作用增加，进而促使血管的生成以及迁移。IL-10上调FcγR(fc-gammareceptors)的表达可增强单核细胞及Mφ吞噬细菌和真菌的能力ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[33-35]。IL-10还可下调了Toll样受体细胞4（toll-likereceptors,TLR4）的表达，并增强了CD14、CD16、CD64和CD13的表达ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[36-37]。以上结果可推断，IL-10可诱导巨噬细胞分化，并且限制正在进行的免疫反应和炎症，同时有助于增强吞噬作用消除感染。动物实验显示，在缺乏IL-10小鼠中发现自发性小肠炎、结肠炎等症状，也可说明IL-10主要功能是限制免疫应答的强度ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[38-39]。2.3Mφ分泌的IL-10在牙周免疫病理中的作用IL-10的主要由Th2细胞、活化B淋巴细胞、单核细胞、Mφ生成，另外，还存在一些其他的细胞也可以诱导分泌IL-10，如CD8+T细胞、Th1细胞、角质细胞（Keratinocyte）以及肥大细胞（mastcell）等。IL-10的抑制作用主要是针对B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核细胞、Mφ以及肥大细胞，通过对促炎因子的抑制作用进而抑制CD4+T细胞合成、从而抑制TNF-α、IL-1β产生。Mφ首先通过对TNF-α、IL-1β的释放促使免疫应答的增强，再通过调节IL-10的释放，反馈性抑制相关炎症细胞因子的释放，从而达到免疫反应的平衡ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[40-41]。IL-10对牙周所起到的保护机制可能是由于抑制促炎因子及粘附因子、趋化因子的生成，减少了中性粒细胞及单核细胞迁移到炎症组织从而促使牙周修复。牙周炎中IL-10呈弥散式分布，且分布的十分广泛，在正常牙龈组织的Mφ中检出IL-10表达明显，在牙周炎组织的Mφ中只能检出少量的IL-10表达。实验研究显示，在牙周炎中，IL-10mRNA细胞呈阳性的较少，且一般情况下以牙龈的固有层的分布为主，其中有的着色清晰易识别，有的集中分布在血管的周围，于上皮层无法见到较为明显的阳性表达的信号。Lappin等ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[42]认为IL-10细胞在牙周组织中的表达增多即为牙周炎静止期的组织损伤特征，通过使用刮治及根面平整等对牙周炎进行治疗，使得IL-10表达增加，表明其促使了牙周的修复。通过逆转录PCR反应对牙龈健康组以及牙周炎组中IL-10mRNA的表达情况进行对比研究，可知牙周炎组的IL-10mRNA表达水平较健康组显著减少ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[43]。通过采取多克隆抗体检测法对牙周炎的炎症组织中的IL-10的表达情况进行检测，可以发现Th2细胞在牙周炎的早期稳定期以及成人牙周炎的炎症组织中的表达水平较高ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[42]。因为没有系统性的对Mφ中的IL-10的表达情况作出研究，所以，对于牙周组织中Mφ的IL-10对牙周致病菌抗原的识别过程以及对牙周病的调节免疫机制的阐述仍不明确。3、Mφ分泌的TNF-α与牙周炎关系的研究进展3.1TNF-α的结构Carswell等ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[44]于1975年在实验研究中发现，在小鼠的血清中发现肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor,TNF）。在此之后，通过对TNF的进一步研究，发现其不仅具有针对肿瘤细胞的细胞毒性作用，还可以参与免疫调节以及多个炎症反应过程。依据不同的来源以及结构组成，TNF分为TNF-α和TNF-β。其中，TNF-α即恶液素（cachectin），生成部位为活化的单核巨噬细胞；TNF-β即淋巴毒素（lytnphotoxin），生成部位是淋巴细胞。在宿主的免疫防御系统中，TNF具有广泛的致炎作用以及免疫调节作用，并且在病理状态下如败血症、牙周炎等皆出现表达过度的情况。TNF基因与主要组织相容性复合物基因紧密连锁。TNF-α基因位于HLA-DR（humanleukocyteantigens,HLA）和HLA-B位点之间的HLA-Ⅲ抗原基因簇，即染色体6p21.4区域ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[44-46]。TNF-α与TNF-β基因的组成均是3个内含子和4个外显子，除了第四个外显子之间高度同源之外，其余内含子及外显子都是不同源的ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[47]。TNF基因簇具备多中类型的多态性，如单个核苷酸的多态性（singlenucleotidepolymorphisms,SNP）、限制片段长度的多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）以及微卫星的多态性ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[48-49]。Udalova等ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[45]已经发现在TNF中存在五种微卫星即TNFa～e，TNFa、b、d是多等位基因，具有高度的多态性，TNFc是双等位基因，TNFe是三等位基因，此外有研究表明，上述等位基因和人类的MHCⅠ、Ⅱ位点之间存在着连锁不平衡性。有实验研究显示，TNF-α的含量与个体的牙周炎的患病易感性以及病变的程度相关ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[50-51]。Calbraith等ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[52-53]研究认为在重度牙周炎的患者中存在的TNF2（G/A）基因型人数比例较大。TNF通过与TNF受体（TNFR）进行结合发挥作用，TNF-α家族中最早被发现的TNF受体为TNFR1及TNFR2，TNFR1参与了TNF-α所有的活性功能，包括细胞凋亡、分化、增殖、抗菌和PGE的合成，TNFR2则介导部分特定细胞的功能如胸腺T细胞的增殖以及胰岛素的拮抗作用等ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[54-56]。3.2TNF-α的生物学效应TNF-α通过与其受体相结合，从而启动鞘磷脂酶-神经酞胺（Sphingomyelinase-ceramide）信号转导通路、激活转录因子NF-Kβ（nuclearfactor-Kβ）的信号通路、蛋白激酶（proteinkinases）通路等，促进单核细胞及Mφ对IL-1、IL-6、IL-8、以及TNF-α的分泌，形成细胞因子级联反应。依据有关研究可知，TNF还能够通过增强激活中性粒细胞，从而使其表达的白细胞分化出抗原复合物CD11+/CD18+。另外TNF-α还能激活EC使其表达细胞间粘附分子1与内皮细胞豁附分子1，使白细胞与EC之间产生作用，促进活性氧以及弹性蛋白酶的大量释放，并将损伤EC以及器官组织细胞，刺激EC细胞释放凝血因子III（bloodcoagulationfactorIII），进而启动凝血机制ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[57-58]。3.3Mφ分泌的TNF-α在牙周免疫病理中的作用目前，通过大量的实验研究均可显示TNF-α是由活化Mφ分泌，但在中性粒细胞、自然杀伤细胞（naturalkillercells,NK）、成纤维细胞（fibroblast）以及肥大细胞中也可诱导分泌TNF-αADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[59]。在牙周炎中，TNF-α作用于EC，诱导其合成黏附因子，进而使白细胞尤其是中性粒细胞以及单核细胞向EC黏附以及向组织内游出。TNF-α还能介导生成各类效应T细胞、抗体以及促进B细胞的分化，通过对成纤维细胞的刺激而进一步生成PGE以及胶原酶，提升破骨细胞的活性ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[60]。TNF-α的骨吸收的机制为使破骨细胞含量增多，同时降低骨基质的钙化程度。TNF-α还能够通过对纤维细胞的组织结构进行改变，从而重组细胞骨架，并且介导合成胶原酶（collagenase）而促进胶原纤维(collagenfibers)的降解，因此可知，TNF-α是促进牙槽骨吸收的一个重要的细胞因子ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[61]。有报道称：如果对牙周组织中TNF-α及其受体的结合过程加以抑制，那么可以降低牙槽骨炎症部分的骨吸收能力ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[62]。4、本课题的研究目的和意义本次研究通过收集病变程度不同的牙周炎患者牙龈组织样本，制作组织学切片，采用H&E染色法、免疫组织化学以及免疫荧光双染色法，对牙龈组织的炎症程度、Mφ以及双阳性Mφ的表达情况进行观察。通过对牙周炎牙龈组织的炎症程度等级评分、计算Mφ、CD14-IL-10和CD14-TNF-α双阳性Mφ的表达密度。分析Mφ、CD14-IL-10和CD14-TNF-α双阳性Mφ与慢性牙周炎的病变程度的相关性及其在牙周感染中的作用和作用机制；阐明Mφ、CD14-IL-10和CD14-TNF-α双阳性Mφ在宿主免疫反应中的功能特征。研究结果将对后续以CD14-IL-10和CD14-TNF-α双阳性Mφ为靶点的研究慢性牙周炎的免疫预防提供分子基础和实验根据。材料与方法1.1实验器材1．1主要实验仪器及设备（表1）1.2主要实验试剂及药品（表2）2.病例选择、分组及标本收集2.1牙周炎病例选择收集2015年12月-2016年6月就诊于中山市人民医院的牙周科门诊并自愿加入本研究的80例患者，年龄在20~60岁，其中男47例（46岁±15岁），女33例(39岁±13岁)，患者年龄以及性别均不存在统计学差异。研究对象纳入标准：一年内未进行过牙周手术的治疗；患有糖尿病的患者要被排除；排除处于妊娠期者；患有其他系统性疾病的患者也不能参与研究；短时间内服用过避孕药的患者要进行排除；同时，研究对象需要满足三个月内没有服用过抗生素类的药品的条件；在进行收集中重度慢性牙周炎患者牙龈组织之前，其必须作牙周基础治疗，且在疗程结束后牙周袋底仍存在出血（bleedingonprobing，BOP）现象者。2.2分组及标本收集2.2.1分组依据依据于1999年的美国牙周病学会制定的牙周病新分类作为标准ADDINCNKISM.Ref.{646DCD11914A4603AC2A731679D23A06}[63]，将本次研究的80例患者平均分为四组，分别通过牙龈指数（GI）、牙周附着水平(AL)、牙周探诊深度（PD)作为评估标准。2.2.2确定分组，收集标本1)正常对照组：收集由于口腔正畸治疗需拔除但健康的前磨牙牙龈组织：无炎症、附着丧失、牙周袋以及牙槽骨吸收且BOP(-)。2)轻度慢性牙周炎组：收集临床牙冠延长术治疗的牙龈组织：轻度炎症、附着丧失不超过3mm、牙周袋深度不超过4mm以及X线片可见牙槽骨吸收程度在根长为1/3以内且BOP(+)。3)中度慢性牙周炎组：收集需进行牙周翻瓣术治疗的内斜切口牙龈组织：炎症较为明显、牙周袋深度在4-6mm、附着丧失水平在3-5mm且X线片可见牙槽骨吸收程度超过根长的1/3但在根长的2/3以内、患牙根部存在轻度松动以及分叉处轻度病损的可能且BOP（+）。4)重度慢性牙周炎组：收集必须拔除的患牙或预后不良的患牙的牙龈组织：明显炎症、附着丧失水平超过5mm、牙周袋深度超过6mm、X线片可见牙槽骨吸收程度超过根长的2/3、患牙根分叉区域存在较严重的病损，其牙齿有多数松动且BOP(+)。3.实验操作方法3.1配制浓度为10%中性福尔马林固定液使用电子天平进行称重获得16.4g的NaH2P04.12H20以及5.2g的NaH2P04.2H20，采用100ml40%甲醛溶液溶解配置好的NaH2P04.12H20、NaH2P04.2H20，再倒入纯净蒸馏水900ml，而后通过精准度高的pH计对溶液的酸碱度进行测定，且依据测定的pH值逐滴加入高浓度的NaOH或者HCl溶液，进而将溶液逐渐调至中性。3.2标本的处理将所收集的牙龈组织标本加以处理，使用生理盐水对标本进行荡洗2-3次，每次2-3sec，然后再将制备完成的标本于10%中性福尔马林固定液即pH=7.0至少放置48h。3.3制备组织切片玻片的处理：首先将载玻片与盖玻片在清洁液中放置24h，再使用蒸馏水冲洗3min，共冲洗5次，之后置于95%酒精中进行浸泡2h,干燥后放置在干燥箱中以作备用。1)脱水：将使用梯度酒精对已制备好的标本进行脱水处理，过程依次为：流动水进行漂洗4-5h，再依次置于75%酒精3h、80%酒精2h、90%酒精1h、95%酒精(I)1h、95%酒精(II)1h、无水乙醇(I)1h以及无水乙醇(II)1h浸泡处理；2)透明：运用二甲苯处理，使切片呈透明状态，过程依次为：二甲苯乙醇(1：1)浸渍15min、二甲苯(I)浸渍20min、二甲苯(II)浸渍20min；3)浸蜡以及包埋，过程为：将组织置入熔点65℃的石蜡浸渍1h，然后再采用熔点62℃的石蜡进行包埋。3.4组织学染色及观察1)将石蜡切片加以常规脱蜡：先将切片放于62℃烤箱中30min，再使用二甲苯(I)浸渍15min、二甲苯(II)15min；2)采用梯度酒精对切片作复水，过程依次为：分别浸渍在无水乙醇(I)15min、无水乙醇（II）15min、95%酒精5min、90%酒精5min、80%酒精5min、75%酒精5min后，取出切片再使用蒸馏水进行冲洗3min后将水分甩干；3)苏木素染色：先将切片放在苏木素液中浸渍10-15min，取出后再使用流动水对其进行漂洗3min，再使用1%盐酸酒精快速分化1～2sec，然后使用蒸馏水进行对切片继续漂洗1min，再把甩干水分，并且放在中和碱溶液中浸渍1min，最后使用流动水漂洗3min后将水分甩干；4)酒精脱水，过程依次为：分别置于80%酒精3～5min、95%酒精（Ⅰ）3～5min、95%酒精（Ⅱ）3～5min进行脱水处理；5)伊红染色：先将切片放在1%酒精伊红液浸渍10min，然后依次继续使用无水乙醇（Ⅰ）5sec、无水乙醇（Ⅱ）5sec、无水乙醇（Ⅲ）5sec加以洗涤，将水分甩干；6)透明、封片：先使用二甲苯（Ⅰ）以及二甲苯（Ⅱ）对切片进行作透明处理各3min，再使用中性树脂进行封片；3.5免疫组织化学染色及观察1)将石蜡切片加以常规脱蜡：先将切片放于62℃烤箱中30min，再使用二甲苯(I)浸渍15min、二甲苯(II)15min；2)采用梯度酒精对切片作复水，过程依次为：分别浸渍在无水乙醇(I)15min、无水乙醇（II）15min、95%酒精5min、90%酒精5min、90%酒精5min、80%酒精5min、75%酒精5min后，取出切片再使用蒸馏水进行冲洗3min后将水分甩干；3)PBS缓冲液对切片进行洗涤3次，每次3min；4)微波辐射抗原修复：在柠檬酸盐缓冲液中将切片完全浸没，使用微波炉高火加热至100℃，改用中火继续加热切片20min，然后放在室温下冷却至常温；5)再次使用PBS缓冲液对切片进行洗涤3次，每次3min；6)内源性过氧化物：在全部的组织切片上滴加3%H2O2去离子水（SP免疫组化检测试剂盒），在室温下对切片进行孵育10min；7)PBS缓冲液洗涤3次，每次3min；8)封闭：将组织切片上的PBS磷酸盐缓冲液倾除，在全部的切片组织上滴加正常山羊血清工作液(SP免疫组化检测试剂盒A液)，然后再将切片放在湿盒中，并在室温下将其孵育15min，然后再倒出工作液，且使用干净的滤纸将多余封闭液吸干，不用清洗；9)一抗孵育：稀释比例按照1：100的Mouse-Anti-CD14+（SantaCruz,USA）、RabbitAnti-TNF-α+(Abcam,UK)、Rabbit-Anti-IL-10+（Abcam,UK）滴加于组织切片上，于湿盒中进行孵育，置入4℃冰箱内过夜（12～18h）；10）复温：将湿盒复温30min到室温后，PBS磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次10min；11)二抗孵育：在全部的切片标本上滴加生物素化二抗工作液IgG(SP免疫组化检测试剂盒B液)，然后将切片放在湿盒中，于室温下降切片孵育15min；12)PBS缓冲液洗涤3次，每次3min；13)链霉卵白素：在全部的切片组织上均滴加工作液(SP免疫组化检测试剂盒C液)，然后将切片放在温盒中，于室温下降切片孵育15min；14)PBS缓冲液洗涤3次，每次3min；15)显色剂进行显色：选取DAB显色试剂盒，从中取得1ml试剂2(DAB底物液)，再倒入50μL试剂1(DAB浓缩液)，混合均匀后配置成DAB工作液，在切片上滴加DAB工作液，放置在显微镜下，且处于室温下，进行观察切片，如若发现显色，则控制切片的显色时间，在显色反应5min后，继续使用蒸馏水对切片进行冲洗以终止显色反应；16)流动水进行漂洗20min；17)Mayor's苏木素再一次轻度染色10min；18)流动水再次进行漂洗20min；19)蒸馏水进行洗涤3min；20)采用梯度酒精对切片作复水，过程依次为：分别浸渍在无水乙醇(I)15min、无水乙醇（II）15min、95%酒精5min、90%酒精5min、90%酒精5min、80%酒精5min、75%酒精5min后，取出切片再使用蒸馏水进行冲洗3min后将水分甩干；21)透明以及封片：首先选择二甲苯（Ⅰ）以及二甲苯（Ⅱ）对切片进行作透明处理各3min，在使用中性树脂进行封片；22)放置在光学显微镜下，对各组牙龈标本IHC染色情况进行观察。3.6免疫荧光双染色及观察1)将石蜡切片加以常规脱蜡：先将切片放于62℃烤箱中30min，再使用二甲苯(I)浸渍15min、二甲苯(II)15min；2)采用梯度酒精对切片作复水，过程依次为：分别浸渍在无水乙醇(I)15min、无水乙醇（II）15min、95%酒精5min、90%酒精5min、90%酒精5min、80%酒精5min、75%酒精5min后，取出切片再使用蒸馏水进行冲洗3min后将水分甩干；3)PBS缓冲液对切片进行洗涤3次，每次3min；4)微波辐射抗原修复：在柠檬酸盐缓冲液中将切片完全浸没，使用微波炉高火加热至100℃，改用中火继续加热切片20min，然后放在室温下冷却至常温；5)PBS缓冲液对切片进行洗涤3次，每次3min；6)内源性过氧化物：在全部的组织切片上滴加3%H2O2去离子水（SP免疫组化检测试剂盒），在室温下对切片进行孵育10min；7)PBS缓冲液对切片进行洗涤3次，每次3min；8)封闭：将组织切片上的PBS磷酸盐缓冲液倾除，在全部的切片组织上滴加正常山羊血清工作液，然后再将切片放在湿盒中，并在室温下将其孵育15min，然后再倒出工作液，且使用干净的滤纸将多余封闭液吸干，不用清洗；9)一抗孵育：将所有的组织切片均分为三组即①按照1：100稀释的Mouse-Anti-CD14+、1：100稀释的Rabbit-Anti-TNF-α+；②按照1：200稀释的Mouse-Anti-CD14+、1：100稀释的Rabbit-Anti-IL10+；③阴性对照组：PBS磷酸盐缓冲液，并且分别滴入适量的稀释浓度的一抗溶液；在置于湿盒中，放置在4℃的冰箱内过夜即12h-18h；10)复温：将湿盒复温30min到室温，再用PBS磷酸盐缓冲液荡洗3次，每次10min；11)二抗孵育：将1：200稀释的抗HRP标记山羊抗兔鼠二抗液滴加于每张组织切片上，然后将切片放在湿盒中，于室温下降切片孵育15min；12)PBS缓冲液对切片进行洗涤3次，每次3min；13)核染：以PBS为稀释液，在全部的组织切片上滴加按照1：500比例稀释的DAPI溶液，进行避光处理，并在于室温下对切片进行孵育15min；14)PBS缓冲液对切片进行洗涤3次，每次3min；15)封片：使用抗荧光淬灭的封片剂对切片以封片处理。16)免疫荧光双染的切片进行封片后进行避光处理，并且放在4℃冰箱中，一周内分别将切片放在荧光显微镜以及共聚焦显微镜下对标本中的阳性细胞的表达情况进行观察，选取己知CD14+-TNF-α+、CD14+-IL-10+细胞荧光组织切片作为阳性对，PBS为一抗的阴性对照；3.7牙龈组织组织学染色结果的处理选取H&E染色法进行染色，在显微镜下对各组切片组织的变化进行观察。选择2名病理医师以盲法进行观察标本，按照炎症的等级方法，并且依据炎症细胞的浸润程度计分并取均值。炎症的程度的评分标准为：1）无明显炎症；2）轻度炎症：炎症细胞呈局灶状浸润；3）中度炎症：炎症细胞呈片状或灶状浸润；4）重度炎症：炎症细胞呈弥漫性浸润。3.8牙龈组织免疫组织化学染色结果的处理选取IHC染色法进行染色，在光学显微镜下观察到牙龈组织切片中CD14、IL-10、TNF-α阳性信号为棕褐色或黑褐色。光学显微镜(x400)下，选择2名病理医师对切片进行盲法观察，选取CD14、IL-10、TNF-α阳性细胞数目最多的5个视野进行计数，分别记录细胞总数、CD14、IL-10、TNF-α阳性细胞数。计算CD14、IL-10、TNF-α平均阳性细胞率（%），取平均值。3.9牙龈组织免疫荧光双染色结果的处理一抗分别选取鼠来源的抗-Mφ-CD14和兔来源的抗-TNF-α以及抗-IL-10，二抗分别选用抗-鼠和抗-兔进行种属间相对应的荧光信号标记。MφCD14+免疫荧光信号表达是绿色荧光，TNF-α+以及IL-10+的免疫荧光信号表达是红色荧光。采用DAPI染核，使细胞核在荧光显微镜下表达是蓝色荧光。在同一个视野范围内，绿光、红光以及蓝光三个颜色重合在一块后即呈现为橘黄色荧光。选择2位病理医师于荧光显微镜下盲法观察组织切片，对CD14+-TNF-α+、CD14+-IL-10+细胞进行计数，并通过测量组织切片的面积，获得CD14+-TNF-α+、CD14+-IL-10+细胞密度，并取平均值。4.统计学分析数据的表达方式即均数±标准误(mean±SEM)，通过使用统计学软件SPSS13.0对数据加以处理和分析：1)各组牙龈组织的炎症程度评分将采用Kruskal-WallisH检验，因其为原始数据多个独立样本进行对比，若结果显示4组的炎症程度存在差异性，那么将采用多样本两两进行对比的Nemenyi法进行检验。2)各组之间平均阳性细胞率、CD14+-TNF-α+以及CD14+-IL-10+细胞平均密度，均使用完全随机设计的单因素方差分析(one-wayANOVA)以及Levene法进行方差齐性检验。若方差齐性时，多个样本均数间每两个均数的对比则将使用Bonferroni法，方差不齐时则使用Tamahane＇sT2法。3)各组实验标本的Mφ平均阳性细胞率与慢性牙周炎病变程度之间，CD14+-TNF-α+细胞、CD14+-IL-10+细胞平均密度和慢性牙周炎病变程度之间，将分别采取Pearson相关分析。4)检验水准是双侧a=0.05，P＜0.05时在统计学上存在差异性，则存在统计学意义结果1.组织学观察结果1）正常对照组：胶原纤维多见（附图1A）；2）轻度慢性牙周炎：上皮下纤维结缔组织呈束状增生，只有较少的炎性细胞浸润（附图1B）；3）中度慢性牙周炎：上皮下纤维结缔组织水解破坏，束间见大量的炎性细胞浸润（附图1C）；4）重度慢性牙周炎：上皮下纤维组织出现溶解以及变形，可见大量炎症细胞（附图1D）。各组慢性牙周炎牙龈组织的炎症程度见图1，结果显示：1）与正常对照组对比，三组慢性牙周炎患者的牙龈组织中炎症细胞均显著增加(P＜0.01)；2）随着牙周炎病变程度的加重，牙龈组织中炎症细胞显著增加(P＜0.01)。Fig.1Gingivalinflammationscoreineachgroup.Dataarerepresentedasmean±SD.Kruskal-WallisHandNemenyitestanalyzedsignificantdifferencesbetweengroups.*#▲P＜0.01comparedtohealthy;#P＜0.01comparedtomildchronicperiodontitis;▲P＜0.01comparedtomildandmoderateperiodontitis.2．免疫组织化学染色观察结果2.1牙龈组织CD14免疫组织化学结果1）正常组：可见散在分布数量较少的CD14表达（附图2A）；2）轻度牙周炎组：可见少量CD14阳性细胞（附图2B）；3）中度牙周炎组：CD14阳性细胞显著增加（附图2C）；4）重度牙周炎组：CD14广泛表达（附图2D）；阴性对照组结果为阴性，基本未见阳性细胞表达（附图3）。各组慢性牙周炎组织的CD14平均阳性细胞率见图2，结果显示：1）与正常组对比，三组慢性牙周炎患者的CD14平均阳性细胞率均显著上升(P＜0.01)；2）CD14平均阳性细胞率随着牙周炎的严重程度增加显著上升(P＜0.01)。Fig.2TheaverageratioofCD14+cellsindifferentgroupsofgingivaltissues.Dataarerepresentedasmean±SD.Tamhane＇sT2testanalyzedsignificantdifferencesbetweengroups.*#▲P＜0.01comparedtohealthy;#P＜0.01comparedtomildchronicperiodontitis;▲P＜0.01comparedtomildandmoderateperiodontitis.2.2牙龈组织IL-10免疫组织化学结果1）正常组牙龈组织可见大量分布的IL-10表达(附图4A)；2）轻度牙周炎组牙龈组织中IL-10阳性细胞数有所减少(附图4B)；3）中度牙周炎组织中IL-10阳性细胞显著降低(附图4C)；4）重度牙周炎组牙龈组织仅见少量的IL-10阳性细胞表达(附图4D)。各组慢性牙周炎组织的IL-10平均阳性细胞率见图3，结果显示：1）与正常组对比，三组慢性牙周炎患者的IL-10平均阳性细胞率表达水平均显著下降(P＜0.01)；2）随着慢性牙周炎的病变程度加重，IL-10平均阳性细胞率水平随之显著下降(P＜0.01)。Fig.3TheaverageratioofIL-10+cellsindifferentgroupsofgingivaltissues.Dataarerepresentedasmean±SD.Tamhane＇sT2testanalyzedsignificantdifferencesbetweengroups.*#▲P＜0.01comparedtohealthy;#P＜0.01comparedtoslightchronicperiodontitis;▲P＜0.01comparedtoslightandmoderateperiodontitis.2.3牙龈组织TNF-α免疫组织化学结果1）正常组：可见散在分布数量较少的TNF-α表达（附图5A）；2）轻度牙周炎组：TNF-α阳性细胞的数目少量增加（附图5B）；3）中度牙周炎组：TNF-α阳性细胞显著增加（附图5C）；4）重度牙周炎组：TNF-α广泛的表达（附图5D）。各组慢性牙周炎组织的TNF-α平均阳性细胞率见图4，结果显示：1）与正常组对比，三组慢性牙周炎患者的TNF-α平均阳性细胞率表达水平均显著上升(P＜0.01)；2）随着慢性牙周炎的病变程度加重，TNF-α平均阳性细胞率水平随之显著上升(P＜0.01)。Fig.4TheaverageratioofTNF-α+cellsindifferentgroupsofgingivaltissues.Dataarerepresentedasmean±SD.Tamhane＇sT2testanalyzedsignificantdifferencesbetweengroups.*#▲P＜0.01comparedtohealthy;#P＜0.01comparedtoslightchronicperiodontitis;▲P＜0.01comparedtoslightandmoderateperiodontitis.3.免疫荧光双染色观察结果3.1Mφ-IL-10免疫荧光双染色结果CD14+免疫荧光信号表达是绿色荧光，IL-10+免疫荧光信号表达为红色荧光，在细胞浆和/或细胞膜例均观察到绿色以及红色的荧光的定位，细胞核荧光信号表达为蓝色荧光，同一视野中的红光与绿光重叠后为橙黄色荧光。免疫荧光双染色结果显示：1）正常对照组：牙龈组织观察到广泛分布的CD14+-IL-10+细胞，特异性橙黄色荧光为强阳性，观察到CD14+-IL-10+主要在牙龈结缔组织区表达（附图6，附图15）；2）轻度慢性牙周炎组：相较于正常对照组，观察到牙龈组织中CD14+-IL-10+细胞数量稍下降，特异性橙黄色荧光染色强度是中等阳性（附图7）；3）中度慢性牙周炎组：可见稀少的CD14+-IL-10+细胞，特异性橙黄色荧光着色强度是弱阳性（附图8）；4）重度慢性牙周炎组：CD14+-IL-10+细胞几乎不可见，特异性橙黄色荧光着色强度微弱（附图9）。阴性对照组结果为阴性，基本未见荧光表达（附图10）。各组慢性牙周炎牙龈组织的CD14+-IL-10+细胞的密度见图5，结果显示：1）与正常组对比，三组慢性牙周炎患者的CD14+-IL-10+细胞的密度显著下降(P＜0.01)；2）随着慢性牙周炎的病变程度加重，CD14+-IL-10+细胞的密度随之显著下降(P＜0.01)。Fig.5ThedensityofCD14+-IL-10+cellsineachgingivaltissuewasanalyzed.Dataarerepresentedasmean±SD.Tamhane'sT2testanalyzedsignificantdifferencesbetweengroups.*P＜0.01comparedtohealthy;#P＜0.01comparedtoslightchronicperiodontitis;▲P＜0.01comparedtoslightandmoderateperiodontitis.3.2Mφ-TNF-α免疫荧光双染色结果CD14+免疫荧光信号表达是绿色荧光，TNF-α+表达为红色荧光，在细胞浆和/或细胞膜例均观察到绿色以及红色的荧光的定位，细胞核荧光信号表达为蓝色荧光，同一视野中的红光与绿光重叠后为橙黄色荧光。免疫荧光双染色结果显示：1）正常对照组：牙龈组织中可见少量不均匀分布的CD14+-TNF-α+细胞，特异性橙黄色荧光着色几乎不可见(附图11)；2）轻度慢性牙周炎组：相较于正常对照组，牙龈组织中CD14+-TNF-α+细胞数量稍上升，特异性橙黄色荧光染色的强度呈现呈现弱阳性(附图12)；3）中度慢性牙周炎组：可见CD14+-TNF-α+细胞数量显著上升，特异性橙黄色荧光染色的强度呈现阳性(附图13)；4）重度慢性牙周炎组：可见广泛分布的CD14+-TNF-α+细胞，特异性橙黄色荧光着色强度呈强阳性，并且Mφ存在显著的脱颗粒现象(附图14，附图16)。各组慢性牙周炎牙龈组织的CD14+-TNF-α+细胞的密度见图6，结果显示：1）与正常组对比，三组慢性牙周炎患者牙龈组织CD14+-TNF-α+细胞的密度显著升高(P＜0.01)；2）随着慢性牙周炎的病变程度加重，CD14+-TNF-α+细胞的密度随之显著升高(P＜0.01)。Fig.6ThedensityofCD14+-TNF-α+cellsineachgingivaltissuewasanalyzed.Dataarerepresentedasmean±SD.Tamhane'sT2testanalyzedsignificantdifferencesbetweengroups.*#▲P＜0.01comparedtohealthy;#P＜0.01comparedtoslightchronicperiodontitis;▲P＜0.01comparedtoslightandmoderateperiodontitis.4.免疫阳性细胞与慢性牙周炎病变程度相关性分析结果在进行Pearson相关分析后，结果显示：与正常对照组相比，各个慢性牙周炎组CD14、TNF-α平均阳性细胞率显著上升，慢性牙周炎组IL-10平均阳性细胞率显著下降，依据图7的统计图分析结果可知CD14的相关系数：r=0.972，P=0.000；TNF-α的相关系数：r=0.968，P=0.000；IL-10的相关系数：r=-0.964，P=0.001结果显示CD14、TNF-α平均阳性细胞率与慢性牙周炎的病变程度存在正相关关系，IL-10平均阳性