第二章基因工程制药

BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药基因工程制药GeneEngineeringforPharmaceutics

（五）BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药1.简述大肠杆菌基因表达产物的分离纯化。2.基因工程药物分离纯化的一般流程。3.分离纯化目的产物的四类色谱分离技术的原理及选择原则。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药第七节基因工程药物的质量控制一、原材料的质量控制

确保编码药品的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药一、原材料的质量控制（1）明确目的基因的来源、克隆经过，并以限制性内切酶图谱和核苷酸序列等予以确证；（2）提供表达载体的名称、结构、遗传特性及其各组成部分（如启动子、复制子）的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标志物；BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药（3）提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性；（4）阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态，如是否整合到染色体内及在其中的拷贝数，并证明宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性；一、原材料的质量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药（5）提供插入基因与表达载体两侧端控制区的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中，启动与控制克隆基因在宿主细胞中表达的方法及水平等。一、原材料的质量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。二、培养过程的质量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药（1）生产基因工程产品应有种子批系统，并证明种子批不含致癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批建立生产用工作细胞库；（2）原始种子批须确证克隆基因DNA序列，详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性；二、培养过程的质量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药（3）对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料，并控制微生物污染；（4）提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细胞-载体系统稳定性，确定最高允许传种代数；二、培养过程的质量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药（5）培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征；以宿主细胞-载体稳定性与产品恒定性，规定持续培养时间，并定期评价细胞系统和产品；二、培养过程的质量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药（6）培养周期结束时，应检测宿主宿主细胞载体系统的特性，如质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度，含插入基因载体的酶切图谱等。二、培养过程的质量控制BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药三、纯化工艺中的质量控制1、产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白质、DNA与热原质都控制在规定限度以下。

2、在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核算、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质，并有检测方法。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药四、目标产品的质量控制

电泳方法：SDS,等电聚焦，免疫电泳免疫学方法：RIA,RIDELISA,Immunoblotting

受体结合实验（ReceptorBinding）各种高效液相分析法（HPLC）肽图分析法

EdmanN末端序列分析法圆二色谱（CD）

NMR1、产品的鉴别表3重组蛋白质药物产品常用的鉴别方法BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药（1）肽图分析法（2）氨基酸成分分析（3）部分氨基酸序列分析：N-端15个氨基酸（4）重组蛋白质的浓度测定和相对分子质量测定（5）蛋白质二硫键分析1、产品的鉴别BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药2、纯度分析（1）目的蛋白质含量测定（2）杂质：分蛋白类杂质和非蛋白类杂质。3、生物化学测定4、稳定性考察5、产品一致性的保证1、产品的鉴别BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药

杂质和污染物检测方法

内毒素鲎试剂、家兔热源法宿主细胞蛋白免疫分析、SD、CE

其他蛋白杂质（如培养基）SDS、HPLC、CE、免疫分析残余DNADNA杂交、紫外光谱、蛋白结合蛋白变异肽谱、HPLC、IEF、CE

甲酰基甲硫氨酸肽谱、HPLC、IEF、CE表4基因工程产物中常见杂质和污染物及其检测方法BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药

甲硫氨酸氧化肽谱、氨基酸分析、HPLC、质谱、Edman分析产物变性或聚合脱氨基SDS、凝胶排阻色谱、

IEF、HPLC、

Edman分析、CE

亲和配基脱落SDS、免疫分析氨基酸取代氨基酸分析、肽谱、CE、

Edman分析、质谱微生物（细菌、酵母、真菌）微生物学检查支原体微生物学检查病毒微生物学检查表4基因工程产物中常见杂质和污染物及其检测方法BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药五、产品的保存⒈液态保存

⑴低温保存：液态蛋白质样品在-10~-20℃以下冰冻保存。

⑵在稳定pH下保存：蛋白质较稳定的pH一般在等电点，且多数蛋白质只有在很窄的pH范围内才稳定。因此对保存液态蛋白质样品时小心调到其稳定的pH范围内。

⑶高浓度保存：一般蛋白质在高浓度时比较稳定，因为液态蛋白质容易受水化作用的影响，浓度太低易引起亚基解离和表面变性。

⑷加保护剂保存：2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、多元醇、有机溶剂等。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药五、产品的保存⒉固态保存（干粉或结晶）长期保存蛋白质的最好方法是制成干粉或结晶。在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器中在（内装有干燥剂），保存在0~4℃冰箱即可。为了取样方便和避免取样时吸潮和被污染，可先将样品分装成小瓶，每次用时只取出一小瓶。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药基因工程药物制造实例Question1：生物药物按功能用途分哪几类？本实例为荧光免疫亲和试剂。Question2：在微生物学中，SPA指的是什么？有什么生物学特性？Question3：用作基因表达的微生物宿主细胞有哪些？本实例既是利用基因工程技术，将SPA与绿色荧光蛋白基因重组，利用E.coli表达系统分泌表达该融合蛋白。BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药Vector:BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药TargetgeneQuestion4：怎样获得目的基因？PCR方式获得BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药阳性克隆的筛选BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药目的蛋白的分离纯化Question5：你了解哪些关于基因工程药物的分离纯化方法？BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药BiotechnologicalPharmaceutics基因工程制药思考题1.对由基因重组技术所获得的蛋白质药物产品进行鉴定时，常做哪些项目分析？2.生物技术产品如何保存?Biote